Resumo

Um diagnóstico rápido de meningite bacteriana é essencial para a implantação de terapia correta no paciente com redução de suas complicações e sequelas e para a implementação imediata de ações pela Vigilância Epidemiológica no controle de surtos e epidemias de doença meningocócica. Ensaios de PCR multiplex têm sido empregados para a detecção de várias bactérias causadoras da doença, entretanto a separação dos produtos por eletroforese em gel de agarose torna o ensaio laborioso e demorado. Com o objetivo de obter um ensaio simples e rápido para identificação simultânea de seis das principais bactérias causadoras da doença (Neisseria meningitidis, Men; Streptococcus pneumoniae, Spn; Haemophilus influenzae, Hi; Staphylococcus aureus, Saur; Listeria monocytogenes, List e Streptococcus agalactiae, Saga), foi padronizada uma PCR multiplex combinada a análise de fragmentos através de eletroforese capilar. Para a padronização do ensaio foram empregadas 20 cepas de Men, 20 de Spn, 16 de Hi, 11 de Saur, 16 de List e 7 de Saga. Para avaliação do uso do ensaio em amostras biológicas foram empregadas 314 amostras de líquido cefalorraquidiano (LCR) previamente analisadas por PCR em tempo real (qPCR). A PCR multiplex foi realizada empregando-se 2 uL de DNA e 6 pares de iniciadores específicos para cada bactéria sendo um deles marcado com o fluoróforo FAM ou HEX. Após a corrida no termociclador, 1 uL do produto da PCR foi adicionado em 12 uL de solução contendo formamida e o marcador GeneScan 500 ROX e submetido à eletroforese capilar no sequenciador ABI 3130xl. A análise dos dados foi realizada no programa GeneMapper 4.1. Os tamanhos dos fragmentos amplificados analisados pelo programa foram: 136,5 +/- 0,315 pb para Men; 122,8 +/- 0,435 para Spn; 160,5 +/- 0,292 para Hi; 149,1 +/- 0,661 para Saur; 116,5 +/- 1,5 para List e 146,5 +/- 0,658 para Saga. Entre as amostras de LCR analisadas, 139 foram positivas para Men (136,6 +/- 0,766 pb), 35 para Spn (122,7 +/- 0,830 pb), 24 para Hi (160,3 +/- 0,549 pb) e 116 amostras foram negativas. Não foram detectadas a presença do Saur, List ou Saga em nenhuma das amostras analisadas. Estes resultados apresentaram 100% de concordância com os obtidos pelo ensaio de qPCR para detecção de Men, Spn e Hi. O uso da análise de fragmentos por eletroforese capilar no lugar da eletroforese em gel de agarose simplificou a interpretação dos dados, resultando em um ensaio mais rápido e menos laborioso, constituindo-se em uma nova ferramenta para o diagnóstico laboratorial das meningites bacterianas.