XXI ALAM
Resumo:1739-1


Poster (Painel)
1739-1AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS DE NESTED-PCR PARA DETECÇÃO DE Histoplasma capsulatum var. capsulatum
Autores:Marla Jalene Alves (INPA - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia) ; João Vicentre Braga de Souza (INPA - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia / INPA - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia) ; Amaury dos Santos Bentes (FMT-HVD - Fundação de Medicina Tropical - Dr. Heitor Vieira Dourado / INPA - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia) ; Silviane Bezerra Pinheiro (UFAM - Universidade Federal do Amazonas / INPA - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia)

Resumo

Introdução: A Histoplasmose é uma micose sistêmica causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum var. capsulatum. A gravidade da doença depende da intensidade de exposição ao fungo e do estado imunológico do paciente. A forma disseminada geralmente ocorre em indivíduos imunocomprometidos, como portadores de HIV/AIDS. A pesquisa de métodos moleculares para o diagnóstico da Histoplasmose tem como fundamento possibilitar a sobrevida desses pacientes por se tratar de um método rápido e que possui alta sensibilidade e especificidade. Objetivo: Avaliar protocolos de Nested-PCR descritos na literatura, para a detecção de Histoplasma capsulatum. Materiais e Métodos: A metodologia de extração utilizada envolveu membranas de sílica (QIAmp Tissue and Blood-Qiagen) e foi realizada conforme protocolo do fabricante. As amostras de DNA que apresentaram melhor grau de pureza foram diluídas em diferentes concentrações 100 ng, 10ng, 1ng, 0,1ng, 1x10-2 ng, 1x10-3 ng e 1x10-4 ng, e submetidas à amplificação por PCR e Nested-PCR com base em três metodologias: uma proteína de 100 KDa, o antígeno M e o antígeno H. Os produtos obtidos foram visualizados por eletroforese através de gel de agarose a 0,5% com 3.5µl de SYBR Green, 8µl de amostra com 2µl de corante e 10µl marcador 50pb. Resultados e Discussão: O método de NESTED-PCR que obteve melhor resultado foi o que teve como gene alvo “a proteína de 100 kDa”, que apresentou produtos com uma menor concentração, 0,01ng respectivamente. As três metodologias apresentaram as mesmas dificuldades durante suas realizações, com bandas inespecíficas e contaminação das amostras. Conclusão: Foi possível detectar a presença de H. capsulatum var. capsulatum através da técnica de Nested-PCR. No entanto, este método deve ser melhor avaliado devido a problemas encontrados em sua execução.


Palavras-chave:  Histoplasmose, Protocolo, Nested-PCR