Resumo

Las bacteriocinas son proteínas de síntesis ribosomal, producidas por bacterias. En nuestro laboratorio hemos caracterizado un nuevo polipéptido tipo bacteriocina producido por la cepa Pseudomonas aeruginosa O400. Esta bacteriocina ha sido denominada como gicina A, la cual inhibe el crecimiento solo de bacterias Gram positivo, posee una masa molecular de 7,9 kDa. Los genes involucrados en la síntesis y exportación se localizan en el cromosoma bacteriano y se determinó que actúa mediante un efecto bactericida permeabilizando la membrana plasmática de la célula blanco. Para identificar los elementos genéticos involucrados en la síntesis y exportación de gicina A se generó una colección de mutantes mediante transposición, empleando derivados del transposon Tn5, contenido en el vector pBSL202, como resultado se obtuvieron clones que disminuyeron la capacidad de secretar gicina A sobre un césped de S. aureus; además se realizó una genoteca genómica de P. aeruginosa O400 clonando fragmentos del DNA genómico en el vector de amplio rango hospedero pBBR1MCS-2, la cual se introdujo en P. putida KT2420 como fondo genético. Se obtuvieron clones capaces de inhibir el crecimiento de S. aureus. El análisis bioinformático del DNA plasmidial de uno de los clones secuenciados presenta un gen que codifica para un transportador del tipo ABC. Mediante microscopía de fluorescencia empleando el sistema comercial BacLigth se determinó que gicina A actúa mediante la permeabilización de la membrana de la célula blanco. Para determinar el receptor de gicina, se realizaron ensayos de actividad sobre esferoplastos de E. coli, encontrándose que al eliminar la membrana externa, éstas se vuelven sensibles a la acción de la bacteriocina. Mediante ensayos de sensibilidad en placa se determinó que la cepa mutante de S. aureus ANG133 es resistente a la acción de gicina A. Esta cepa presenta una mutación en los genes que codifican para las enzimas FemAB, por lo cual el translocador (lipid II) no puede soltar las unidades de ensamblaje del peptidoglicano, lo que impide el reciclaje de lipid II, generando así la resistencia a gicina A. Utilizando una cepa reportera de Bacilus subtilis, la cual detecta interferencias en el ciclo de lipid II, demostramos que gicina A no actúa mediante una unión a esta molécula, infiriendo que el receptor para nuestra bacteriocina estaría en los pasos siguientes de reciclaje del translocador. Financiamiento: Proyecto FONDECYT 11090182, VRA-UDP Proyecto Semilla CG13.03.25.013 y CG13.03.25.015.