Resumo

A produção de etanol combustível vem sendo realizada no Brasil desde a implementação do Projeto Pro-Álcool, em 1975. Considerando o aspecto dos microrganismos empregados na conversão da sacarose de cana-de-açúcar, é fato que várias linhagens especiais da levedura S. cerevisiae adaptadas ao processo foram selecionadas, que estas linhagens são adaptadas ao processo que ocorre de cada Usina, e que novas linhagens continuam e continuarão a ser selecionadas nas diversas Unidades de produção. Também é fato que os conhecimentos relativos à genética de S. cerevisiae estão disponibilizados atualmente em enorme quantidade e podem ser empregados para a construção de novas linhagens recombinantes com capacidade incrementada de rendimento de produção de etanol. Em nosso laboratório foi construído um sistema que permite inserir múltiplas cópias de cassetes de expressão desejados no genoma de linhagens da levedura S. cerevisiae, por δ-integração. Os cassetes de expressão inseridos permanecem estáveis ao longo de várias gerações. Foram construídas linhagens S. cerevisiae recombinantes, derivadas da linhagem industrial PE-2, que contêm cópias múltiplas do c-DNA da glicoamilase de A. awamori inseridas nos genomas (Guerra e Vicente,2006; Guerra et al,2006; Vicente e Guerra,2007). Neste trabalho, o gene da α-amilase de Bacillus subtilis foi clonado em S. cerevisiae, por δ-integração. Foram construídos dois vetores: 1)o gene truncado da α-amilase de Bacillus subtilis (amyEt)com sua sequência sinal própria, sob regulação do promotor e terminador ADH1 de S.cerevisiae (δAmyEtδ); 2)o gene da α-amilase completo de Bacillus subtilis(amyE), com a sequência sinal MF&alpha de S. cerevisiae, sob a regulação do promotor e terminador PGK (δAmyEδ). Esses vetores foram empregados na transformação genética de linhagens S. cerevisiae, em co-transformação com o plasmídeo pAJ50, que permite seleção positiva. Os clones transformantes cultivados em meio YPDA (0,5% amido) produziram halos de amilolise de diferentes tamanhos. Os que receberam o gene da α-amilase completo sob a regulação de PGK (δAmyEδ) apresentaram os melhores resultados de hidrólise de amido. Nenhum clone teve o crescimento prejudicado em relação à linhagem controle original. Na próxima fase, será construída uma linhagem derivada de PE-2 contendo cópias múltiplas dos cassetes de expressão glucoamilase (δGlicoδ) e α-amilase (δAmyEδ).