Resumo

A segurança e a deterioração de alimentos por micro-organismos constituem dois pontos de interesse primário na indústria de alimentos e, o estabelecimento de novos métodos para controle destes patógenos torna-se muito importante. Este gênero apresenta espécies que sintetizam substâncias antagonistas contra diversas bactérias patogênicas e deteriorantes dos alimentos, destacando-se a subtilosina A, que tem comprovada eficácia contra Listeria monocytogenes. O objetivo deste trabalho foi testar uma bactéria isolada e identificada como Bacillus subtilis P5 de um produto fermentado da mandioca, denominado puba, frente a 39 espécies de bactérias gram-positivas e gram-negativas e pesquisar a presença do gene relacionado à pré-subtilosina A (sboA). A atividade antibacteriana dos sobrenadantes frente às culturas bacterianas foi determinada de acordo com o método de difusão em ágar segundo Motta & Brandelli (2002) com adaptações. Para a pesquisa de subtilosina A, o DNA de B. subtilis P5 foi extraído (SV Genomic DNA kit - Promega Corporation, Madison, WI, EUA) e o gene sboA foi amplificado por PCR com primers para sboA para a obtenção do fragmento de 734 pb, correspondente ao grupo de genes de subtilosina A de B. subtilis. PCR foi realizado utilizando um Termociclador Mastercycler® Personal Eppendorf e os produtos da PCR foram sequenciados no Laboratório ACTGene (Centro de Biotecnologia, UFRGS, Porto Alegre) usando o sequenciador automático ABI PRISM-3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). O algoritmo BLAST foi usado para recuperar para sequências homólogas no GenBank utilizando o software CLUSTAL W versão 1.8, para o alinhamento das sequências. As análises da atividade antibacteriana revelaram espectro de inibição contra 56% das bactérias testadas, com médias de halos que variaram de 2 mm a 15 mm e, de forma mais significativa, contra as bactérias gram-positivas (68% foram inibidas). A maior inibição de bactérias gram-positivas ocorreu por estas serem filogeneticamente relacionadas com B. subtilis P5, compatível com a definição clássica de bacteriocinas. Dentre todas as bactérias gram-positivas inibidas, as espécies L. monocytogenes ATCC 6477 e B. cereus ATCC 14579 foram selecionadas para serem utilizadas como indicadoras da atividade antimicrobiana nos testes posteriores, em virtude de terem sido mais inibidas pelos sobrenadantes de B. subtilis P5 e por suas implicações na contaminação dos alimentos. A técnica de PCR, seguida de sequenciamento e análise dos amplicons, demonstrou elevada homologia (identidade mínima de 98%) com o gene sboA (subtilosina A). Estes resultados sugerem grande potencial para estudo e produção/aplicação desta substância.