Resumo

As ecto-fosfatases são enzimas de membrana com sítio catalítico voltado para o meio extracelular, capazes de gerar fosfato inorgânico a partir de substratos fosforilados presentes no meio. A microalga dulcícola Euglena gracilis é um euglenóide utilizado como modelo em diferentes áreas. Aqui, caracterizamos uma atividade ecto-fosfatásica de E. gracilis, potencialmente relacionada à geração de fosfato para o flagelado. O cultivo foi realizado em meio rico sob três regimes luminosos: 12h de luz/dia; por 5 dias no escuro ou por 3 meses ou mais no escuro. Após 5 dias, ainda restava no meio de cultura mais da metade do fosfato inorgânico (Pi) adicionado. A atividade ecto-fosfatásica foi determinada colorimetricamente medindo-se a taxa de p-nitrofenol (p-NP) produzido pela hidrólise de p-nitrofenolfosfato (p-NPP). Células íntegras foram incubadas em meio de reação tamponado contendo 5 mM de p-NPP em pH 5,5. E. gracilis possui uma atividade de 2,39 ± 0,16 nmol p-NP/(10⁶ células × h), sem variação nas fases de crescimento da cultura. A hidrólise do substrato foi linear com o tempo por 1 h e com a densidade celular até 5 × 10⁶ células. Além de p-NPP, E. gracilis também foi capaz de hidrolisar fosfotirosina, fosfoserina e fosfotreonina. A atividade enzimática é ácida e os parâmetros cinéticos aparentes dessa atividade são K_0,5 de 2,46 ± 0,52 mM e V_máx de 3,64 ± 0,25 nmol p-NP/(h × 10⁶ células). Os inibidores de fosfatase NaF, vanadato e molibdato, assim como o Pi, produto da reação, foram efetivos nessa atividade. Cloreto de zinco e os fluoretos de alumínio e lítio inibiram a atividade enzimática de forma dose-dependente. Também houve inibição pelo complexo fluoroaluminato, produzido pela combinação de fluoreto de lítio e cloreto de alumínio no meio de reação. Por fim, avaliou-se a influência do regime luminoso na atividade ecto-fosfatásica. A restrição luminosa não influencia no crescimento, mas diminui a atividade ecto-fosfatásica para 1,21 ± 0,17 nmol p-NP/(10⁶ células × h) nas euglenas crescidas no escuro por 5 dias e 0,75 ± 0,10 nmol p-NP/(10⁶ células × h) nas euglenas mantidas no escuro por 3 meses ou mais. As células crescidas por meses no escuro também foram menos sensíveis a NaF, molibdato e Pi, mostrando um perfil diferente de ecto-fosfatases. Dessa forma, caracterizamos uma atividade ecto-fosfatásica ativa em condições de disponibilidade de fosfato e em diferentes regimes luminosos.