Resumo

Ureases (EC 3.5.1.5; uréia amidohidrolase) são metaloenzimas níquel dependentes, que catalisam a hidrólise da uréia à amônia e dióxido de carbono. A soja possui duas isoenzimas, a urease ubíqua, envolvida na biodisponiblização de nitrogênio e a urease embrião-específica, que pode estar envolvida em mecanismos de defesa. A urease embrião-específica purificada a partir da semente apresenta, dentre outras, atividades inseticida e antifúngica. A pequena quantidade da isoforma ubíqua tem impedido estudos de suas propriedades biológicas. Estudos in vivo demonstraram que os níveis de urease ubíqua em soja influenciaram sua susceptibilide a um grande espectro de fungos filamentosos. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi expressar a urease ubíqua em Escherichia coli BL21 RIL, otimizar a expressão e testar a atividade antifúngica. As bactérias foram transformadas por choque térmico com o plasmídeo pGEX-4T-2, contendo o gene da urease ubíqua fusionado ao gene da Glutationa S-Transferase (GST). Para a produção da proteína fusionada a bactéria foi cultivada em meio 2XYT, a 28ºC, 200 rpm e IPTG por 16 horas. Após centrifugação e lise celular em sonicador, o sobrenadante foi submetido à cromatografia de afinidade em Glutationa Sepharose 4B. A proteína de fusão foi eluída com tampão Tris-HCl 50 mM e glutationa reduzida 10 mM, pH 8. As frações foram quantificadas por Bradford e analisadas por SDS-PAGE 10%, confirmando-se a presença de uma banda de 120 kDa. Ao final da purificação, o rendimento foi de 2 mg/L de proteína fusionada. A fim de otimizar a produção, um planejamento fatorial foi elaborado, quantificando-se os extratos bacterianos por ELISA, utilizando como anticorpo primário anti-Jaburetox (1:500) e anticorpo secundário anti-IgG de coelho marcado com fosfatase alcalina (1:10.000). As condições ótimas de indução foram 10 horas, 0,55 mM de IPTG e 24ºC, aumentando-se a produção para 5 mg/L. O modelo foi preditivo com coeficiente de determinação R² de 0,75, com significância de 95%. Testes preliminares com 1µM da proteína fusionada demonstraram que os fungos Rhizoctonia solani, Cescospora chevalieri e Penicillium herguei apresentaram inibição do crescimento em 48 horas de incubação, a 28 °C, 10⁶ esporos/mL. Mais estudos serão realizados, investigando a atividade antifúngica contra outros fungos fitopatógenos, bem como leveduras de importância médica. Apoio: CAPES, CNPq, FAPERGS.