Resumo

Sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica relacionada a um processo infeccioso. A elevada mortalidade e custos em ambientes hospitalares associam-se ao diagnóstico tardio do agente etiológico e à terapia imprecisa à base de antibióticos. Bacilos Gram negativos são os mais frequentes agentes causadores de sepse, destacando-se Acinetobacter baumanni e Klebsiela pneumoniae. com crescente incidência e multirresistência frente a antibióticos. A investigação de microrganismos através da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) tem sido explorada por intermédio dos sistemas de detecção múltipla, Multiplex-PCR, nos quais são empregados dois ou mais pares de iniciadores em uma única reação, possibilitando resultados rápidos, e precisos e uma terapêutica com maiores chances de sucesso. O objetivo do presente estudo foi padronizar a detecção de A. baumannii e K. pneumoniae através de Multiplex-PCR. Métodos: O DNA genômico das cepas padrão A. baumanii ATCC 19606 e K. pneumoniae ATCC 13883 foi extraído e purificado com o kit “Qiamp DNA Mini Kit” (Qiagen). Para avaliar a qualidade do DNA microbiano obtido, foram realizadas espectrofotometria, eletroforese em gel 1% agarose e amplificação com iniciadores bacterianos universais direcionados ao gene codificante para a fração 16S rRNA. A amplificação via Multiplex-PCR foi avaliada utilizando iniciadores seletivos aos microrganismos A. baumannii e K. pneumoniae, variando-se as quantidades de magnésio, e iniciadores e parâmetros da termociclagem. O limite de sensibilidade do sistema foi analisado via diluição seriada (500 ng/µL a 50 fg/µL) de cada DNA microbiano alvo e a especificidade foi testada empregando-se um painel de DNAs microbianos e humano não correspondentes aos iniciadores utilizados na PCR. Resultados e Discussão: Obtiveram-se amplificações em condições únicas de reação e termociclagem: A. baumannii - 732 pb e K. pneumoniae - 374 pb. O sistema demonstrou ser especifico aos microrganismos alvo. A concentração de 5 ng/µL de DNA microbiano correspondeu ao limite de sensibilidade do sistema. Conclusão: Através da Multiplex-PCR, foi possível realizar a detecção simultânea e específica de A. baumannii e K. pneumoniae, em tempo inferior aos métodos de diagnóstico convencionais, permitindo antecipação da identificação microbiana e, em consequência, possibilitaria uma melhor conduta terapêutica.