Resumo

Lactococcus lactis, a bactéria láctica modelo, é considerada segura e vem sendo há muito utilizada para produção e entrega de antígenos e citocinas às superfícies de mucosas. Recentemente, os estudos envolvendo esta bactéria têm também focado em sua utilização como veículo para entrega de vacinas de DNA, plataforma vacinal que envolve a administração de um vetor de expressão eucariótica capaz de codificar proteínas imunogênicas e que apresenta grande potencial como agente profilático. Todavia, apesar das metodologias de entrega de vacinas de DNA até o momento desenvolvidas apresentarem relativa eficiência na entrega dos plasmídeos vacinais às células hospedeiras, estas são falhas em direcioná-los para o núcleo celular, evento crucial para que a ORF de interesse seja expressa e a vacina de DNA desempenhe sua função. Considerando que o envelope nuclear constitui o maior obstáculo à entrada dos plasmídeos no núcleo das células alvo, a otimização do direcionamento destes para o núcleo, bem como a transposição desta barreira é de fundamental importância para a eficácia de uma vacina gênica. Com o objetivo de melhorar os níveis de importação nuclear e de expressão gênica a partir de um plasmídeo vacinal desenvolvido por nosso grupo de pesquisa (pValac), a ser entregue especificamente por uma linhagem invasiva de L. lactis, este trabalho procurou otimizá-lo através da inserção de uma sequência nucleotídica do vírus símio 40, descrita como sendo capaz de direcionar DNA exógeno ao núcleo de células eucarióticas e aumentar a expressão gênica a partir dos plasmídeos que a contenham. Esta sequência, denominada Sequência de Endereçamento Nuclear (DTS) foi clonada no vetor pValac e para avaliação da funcionalidade desta construção, a ORF da proteína verde fluorescente (GFP) foi utilizada como repórter. A avaliação da funcionalidade da construção final pValac:DTS:gfp se deu por meio de sua transfecção em células da linhagem CHO e análises através de microscopia de fluorescência e RT-PCR. Para efeito de comparação entre a expressão de GFP a partir do plasmídeo pValac:DTS:gfp e do plasmídeo controle pValac:gfp, foram realizados ensaios de Citometria de Fluxo. Os resultados mostraram que a presença da DTS no plasmídeo pValac:gfp não foi capaz de aumentar a expressão da proteína GFP, resultados estes que estão em desacordo com a maioria daqueles reportados pela literatura.