Resumo

A Chromobacterium violaceum é uma bactéria presente em solos e águas de regiões tropicais e subtropicais de diversas partes do mundo. É de grande interesse os estudos sobre esta bactéria, pois, além de ser capaz de adaptar-se a ambientes diversos, também produz metabólitos de importância biotecnológica, tais como a violaceína e polímeros de hidroxialcanoatos (PHAs). Os PHAs são acumulados intracelularmente, em algumas espécies de bactérias. Em C. violaceum a produção destes polímeros ocorre quando estas estão em condições ambientais especiais, como por exemplo, em ambientes com excesso de fonte de carbono e deficiência de outro elemento nutricional essencial como nitrogênio, fósforo, enxofre, oxigênio ou magnésio. Distintas composições monoméricas de polihidroxialcanoatos determinam características diferentes aos polímeros, assim como, a biodegradabilidade dos mesmos. Em C. violaceum os três genes envolvidos na produção de PHA são: o phaA (β-cetotiolase), phaC (polihidroxialcanoato sintase) e phaB (acetoacetil-CoA redutase). Esse trabalho descreve a obtenção de uma linhagem de Escherichia coli capaz de produzir a proteína phaB de C. violaceum, bem como a semi-purificação da proteína recombinante. Para tanto, foram utilizadas ferramentas de Bioinformática para analisar a seqüência genômica da phaB, e posterior desenho de primers específicos para amplificação e clonagem. Após, o fragmento de DNA obtido foi digerido (KpnI/XbaI) e introduzido no vetor pBAD/Myc-HisB (Invitrogen). Em seguida, o vetor de expressão foi inserido na bactéria E. coli e as células recombinantes foram isoladas. Para confirmar a identidade dos transformantes foram utilizadas reações de PCR de colônia e digestão dos plasmídios recombinantes, confirmando a construção esperada. Em seguida, a proteína heteróloga foi produzida e semi-purificada por meio de cromatografia de afinidade por metal imobilizado. Como resultado, a linhagem recombinante de E. coli obtida permite a produção da proteína PHA com baixo custo.