Resumo

Ureases são metaloenzimas níquel dependentes, amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas, e que catalisam a hidrólise de uréia à amônia e ácido carbônico. As bactérias patogênicas Helicobacter pylori e Proteus mirabilis possuem ureases que atuam como fator de virulência nas suas infecções. Proteus mirabilis são bactérias gram negativas, e uropatógenos oportunistas, responsáveis por causar severas infecções, especialmente em pacientes cateterizados. A urease de P. mirabilis (PMU), é formada por três subunidades, com alta similaridade frente a outras já descritas, como a urease de Canavalia ensiformis e a urease de Helicobacter pylori. A amônia liberada na hidrólise da uréia pela PMU causa um aumento no pH do meio, formando um microclima que possibilita a colonização do trato urinário do hospedeiro, tornando a PMU um crítico fator de virulência. As condições de cultivo da cepa de Escherichia coli que expressa a PMU foram otimizadas neste trabalho, a fim de proceder a purificação da enzima. Através do Método de Superfície de Resposta, as variáveis de cultivo, concentrações de níquel, de uréia e o tempo de indução foram determinadas em 1 uMolL^-1, 500 mMolL^-1 e 3 horas, respectivamente. A enzima parcialmente purificada foi obtida através de três etapas: uma cromatografia preparativa com gradiente descontínuo de NaCl, seguida de uma etapa analítica, com gradiente contínuo do mesmo sal (ambas em coluna HiTrapQ^TM usando 20 mM NaPB pH 7,5) O pool de atividade eluído da última troca iônica (350 mMolL^-1 de NaCl) foi aplicado em uma coluna de gel filtração Superdex 200^TM 26/60. A enzima foi obtida com um alto rendimento, quando comparada com o material de partida. O pH ótimo determinado para a enzima ficou em 8,0, a partir do pool parcialmente purificado. A interação da PMU com plaquetas e neutrófilos será investigada, para averiguar possíveis efeitos secretagogo e quimiotático, respectivamente, dessa proteína.