Resumo

Los Basidiomycotas degradadores de madera tienen una variedad de aplicaciones útiles para la industria como el bioprocesamiento de lignocelulosa. Los hongos han desarrollado la capacidad de utilizar diferentes fuentes de nitrógeno y en un hábitat tan pobre como la madera, las purinas se convierten en fuentes potenciales. Para comprender la fisiología de estos organismos enfrentados a limitaciones de nitrógeno nos planteamos caracterizar el transporte de purinas hacia el interior celular de dos especies con diferente crecimiento cuando la única fuente de nitrógeno es una purina: P. chrysosporium (basidiomicete modelo) y Punctularia atropurpurascens (aislado de la región). Dos genes phZ y phU de P. chrysosporium identificados por homología de secuencias (genoma secuenciado) y uno de P. atropurpurascens (amplificado con primers degenerados) fueron clonados. La transcripción de estos genes es reprimida en presencia de urea o amonio, inducida en condiciones de carencia y presencia purinas. Demostramos que las proteínas de P. chrysosporium son funcionales ya que restauran, si bien parcialmente, el crecimiento de la cepa mutante Aspergillus nidulans &DeltaazgA &DeltauapA &DeltauapC (no transporta purinas debido a la deleción de los genes de transportadores). Este fenotipo puede atribuirse a una baja capacidad de transporte o afinidad por el sustrato. PhU comparte estructura y motivos conservados con la familia de transportadores NAT-NCS2 (UapA/C) pero se diferencia en 4 residuos identificados como determinantes de función que podrían explicar el fenotipo observado. La esturctura predicha para PhZ y PuZ (10 TMS) es compartida por transportadores AzgA-like, familia muy poco caracterizada no habiendo residuos funcionales identificados. Identificamos cuatro motivos sumamente conservados que la definirían. Para estudiar la funcionalidad (capacidad, especificidad y afinidad) de los transportadores se hacen construcciones que favorecen la integración monocopia en el locus azgA de A. nidulans. La fusión con GFP permite observar la localización subcelular. Este sistema permite analizar mutantes en un mismo contexto genético facilitando la identificación de residuos determinantes de la función.