Resumo

Introducción: Para estudiar la importancia de la selectividad por el NADP de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Escherichia coli (EcG6PDH), se sustituyó esta enzima por otra de igual función pero específica para NAD (NAD-G6PDH). Métodos: La enzima NAD-G6PDH se obtuvo mediante mutagénesis sitio-dirigida de la G6PDH de Leuconostoc mesenteroides, y su preferencia por cofactor fue estudiada mediante curvas de progreso. El cambio de EcG6PDH por NAD-G6PDH se realizó, por recombinación homóloga, en una cepa silvestre (WT) y en una cepa isogénica carente del gen de la fosfo-gluco-isomerasa (Δpgi). Se obtuvo también una cepa que expresa una forma inactiva de la G6PDH (inact-G6PDH). Se estudió el crecimiento aeróbico con glucosa convencional más U-C¹³-glucosa como únicas fuentes de carbono. Se monitorearon las tasas de crecimiento, de captación de glucosa, de producción de acetato, así como la partición de la glucosa entre la glicólisis y la vía de las pentosas mediante la cuantificación de los isotopómeros de C¹³-histidina. Los resultados experimentales se utilizaron para estimar la distribución de los flujos metabólicos internos mediante el Análisis del Balance de los Flujos (FBA). Resultados: La sustitución de la EcG6PDH por la NAD-G6PDH modificó las tasas de captación de glucosa, de producción de acetato y los flujos metabólicos. Como consecuencia, en la cepa Δpgi, la tasa de crecimiento aumentó 44%, pero en la cepa WT la tasa de crecimiento disminuyó en igual porcentaje. Sin embargo, en la cepa con la enzima inact-G6PDH la tasa de crecimiento cayó solamente un 16% con respecto a WT. Las simulaciones con FBA mostraron que las tasas de captación de glucosa observadas corresponden a valores que maximizan el impacto positivo (en WT) o minimizan el impacto negativo (en la mutante NAD-G6PDH) del flujo por la rama oxidativa de la vía de las pentosas sobre el crecimiento. Conclusión: La especificidad por cofactor de la G6PDH es una característica clave para el ingreso y la distribución de la glucosa en Eschericha coli.