Resumo

O veneno de serpentes contêm diversos componentes, alguns dos quais tem sido utilizados em tratamentos e diagnóstico de doenças humanas. Dentre esses componentes encontramos as desintegrinas que são uma família de pequenos peptídeos (4-14 kDa) ricos em cisteína que se ligam seletivamente a receptores de integrina, glicoproteínas que possuem um papel fundamental na regulação de processos fisiológicos e fisiopatológicos, como na trombose arterial. Duas desintegrinas isoladas em nosso laboratório do veneno de Bothrops jararaca são chamadas jarastatina e jararacina. Essas desintegrinas possuem a habilidade promissora de inibir a agregação plaquetária, devido a sua interação com a molécula de integrina. Essas proteínas são obtidas através da técnica do DNA recombinante, sendo necessários sempre ajustes e aprimoramentos no protocolo de expressão. O rendimento obtido tem se mostrado insatisfatório, sendo necessário o aprimoramento do método de expressão. O objetivo deste estudo é desenvolver uma metodologia que seja capaz de aumentar o rendimento das desintegrinas durante a expressão heteróloga, utilizando diversas condições de expressão. Para a obtenção dessas desintegrinas, utilizou-se a bactéria Esherichia coli (E. Coli) BL21 (DE3) que foram inoculadas em diversas condições envolvendo número de células adicionadas, temperatura de crescimento a 25°C over night e uso de diferentes meios, Circle Grow ou LB (Luria-Bertani broth), na presença ou na ausência da adição de glicose. A expressão foi induzida com IPTG e após crescimento over night, foram centrifugadas. Posteriormente, as células foram lisadas em duas condições diferentes e foi feito uma quantificação do rendimento das proteínas total após a lise, seguido da análise do perfil proteico por SDS PAGE 15%. O perfil proteico mostrou que foi possível expressar as desintegrinas, sendo que as bactérias que cresceram no meio Circle grow apresentaram maior expressão. Os extratos foram submetidos a purificação das proteínas recombinantes, utilizando uma coluna de níquel. Através da quantificação e análise do perfil protéico pode-se obter melhor rendimento, cerca de 331,7&mug para rJARC e 263,4&mug para rJAST utilizando maior número de células em meio Circle Grow sem adição de glicose, mostrando que foi possível obter um melhor rendimento de proteínas em relação à metodologia utilizando meio LB e com menor número de células (16,7&mug para rJARC e 14,5&mug para rJAST). Assim podemos concluir que a utilização dessa condição de expressão permite um maior rendimento para a obtenção dessas proteínas. Como perspectivas, as desintegrinas serão expressas em escala maior e terão sua atividade antiplaquetária avaliada.