XXI ALAM
Resumo:348-1


Poster (Painel)
348-1CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE FLAGELINAS RECOMBINANTES DE LEPTOSPIRA INTERROGANS SOROVAR COPENHAGENI
Autores:Denize Monaris (IBU - INSTITUTO BUTANTAN) ; Maria Elisabeth Sbrogio-almeida (IBU - INSTITUTO BUTANTAN) ; Silvio Arruda Vasconcellos (USP - UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO) ; Luis Carlos de Souza Ferreira (USP - UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO) ; Patricia Antonia Estima Abreu de Aniz (IBU - INSTITUTO BUTANTAN)

Resumo

Introdução: A leptospirose é uma zoonose de importância global causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. A transmissão ocorre por meio do contato com a urina de animais infectados. A flagelina, proteína estrutural do flagelo bacteriano, liga-se ao receptor Toll-like 5 (TLR-5) ativando a resposta imune inata. Esta proteína tem sido considerada um adjuvante promissor para o desenvolvimento de vacinas. As leptospiras possuem dois flagelos periplasmáticos que contribuem para a forma helicoidal espiralada e são responsáveis pelos movimentos de rotação e translação. O sequenciamento completo do genoma de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni permitiu a identificação de cinco genes que codificam possíveis flagelinas FlaB, que constituem o núcleo do filamento. O alinhamento das sequências de aminoácidos codificados por estes genes mostrou a homologia com as flagelinas de outras bactérias e a conservação de regiões importantes para a indução da atividade do TRL5. Objetivos: Obter os insertos correspondentes aos genes que codificam as flagelinas FlaB, clonar, induzir, expressar as proteínas recombinantes e purificar por cromatografia de afinidade a metal. Métodos: Os cinco genes de flagelinas FlaB foram amplificados por PCR e clonados no vetor pGEM-T, em seguida foram subclonados no vetor de expressão pAE em E.coli. Para a expressão das flagelinas recombinantes, bactérias da linhagem E.coli BL21-C43 competentes foram transformadas com os plasmídeos. As flagelinas recombinantes possuem na extremidade amino-terminal seis resíduos de histidinas, o que possibilitou sua purificação por cromatografia de afinidade a níquel em condição desnaturante (tampão com alta concentração de uréia e pH ácido), a partir da fração insolúvel. As flagelinas foram avaliadas por gel SDS-PAGE e Western blotting, utilizando-se soro monoclonal anti-His. Resultados e Discussão: As frações de todas as etapas da purificação foram coletadas e analisadas em gel SDS-PAGE. As flagelinas recombinantes apresentaram uma banda majoritária com peso molecular esperado. As concentrações das flagelinas recombinantes foram calculadas pela leitura espectrofotométrica a 280 nm. O anticorpo anti-His foi capaz de reconhecer especificamente as bandas correspondentes às proteínas recombinantes. Financiamento: FAPESP


Palavras-chave:  LEPTOSPIRA, LEPTOSPIROSE, VACINA, ADJUVANTE, FLAGELINA