XXI ALAM
Resumo:329-1


Poster (Painel)
329-1Aportes de la biología molecular al diagnóstico y conocimiento epidemiológico de la Leptospirosis en Uruguay.
Autores:Sabina González (DBYV-IH - Depto. de Bacteriología y Virología-Instituto de Higiene) ; Elba Hernández (DBYV-IH - Depto. de Bacteriología y Virología-Instituto de Higiene) ; Juan Pablo Geymonat (DBYV-IH - Depto. de Bacteriología y Virología-Instituto de Higiene) ; Victoria Balseiro (DBYV-IH - Depto. de Bacteriología y Virología-Instituto de Higiene) ; Paulina Meny (DBYV-IH - Depto. de Bacteriología y Virología-Instituto de Higiene) ; Juan Martín Marqués (DDB-IH - Depto. de Desarrollo Biotecnológico-Instituto de Higiene) ; Felipe Schelotto (DBYV-IH - Depto. de Bacteriología y Virología-Instituto de Higiene) ; Gustavo Varela (DBYV-IH - Depto. de Bacteriología y Virología-Instituto de Higiene)

Resumo

La Leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial, causada por cepas patogénicas del género Leptospira. El diagnóstico etiológico puede hacerse por la recuperación e identificación del agente a partir de muestras clínicas obtenidas en distintas etapas de la infección. Se trata de procesos laboriosos y que requieren incubaciones prolongadas. Otra alternativa es la utilización de ensayos basados en la detección de anticuerpos como la técnica de micro-aglutinación (MAT). Estos procedimientos también presentan inconvenientes: para obtener resultados positivos deben transcurrir varios días luego de la infección y no permiten identificar las especies participantes. El objetivo fue desarrollar y evaluar un procedimiento “hecho en casa”, basado en la técnica cuantitativa de PCR en tiempo real para el diagnóstico rápido de Leptospirosis; asociado a la restricción enzimática del fragmento obtenido para reconocer el grupo de especies involucradas. Se utilizo el equipo Rotor Gene 6000 y los cebadores Lepto A y B que amplifican un fragmento de 331 pb del gen que codifica para la sub-unidad ribosomal 16s. Se utilizó una master mix con SYBR-Green comercial. El volumen de reacción fue de 20 μl, cada cebador se uso a 0,5 μM y en cada tubo se agregaron 2 μl de ADN molde. El protocolo de amplificación consistió en 15 minutos a 95º C seguido por 45 ciclos de 95º C-15 s; 57º C-30 s y 72º C 60 s. La digestión del amplificado se realizó con las enzimas MnlI y HpyF3I. El patrón de bandas esperado para las diferentes especies se estableció previamente por PCR-RFLP in silico. Para determinar la sensibilidad analítica de la q-PCR se procesaron muestras de suero, sangre y plasma, negativos por MAT y contaminados experimentalmente con cantidades conocidas de Leptospira interrogans serovar Pomona. La extracción de ADN se realizó utilizando kits comerciales, siguiendo las indicaciones del fabricante. La eficiencia de la reacción fue mejor en las muestras de suero y la sensibilidad fue de 102 bacterias/ml. La RFLP q-PCR representa una alternativa útil para el diagnóstico precoz de la infección por Leptospira en laboratorios que cuentan con la infraestructura necesaria y procesan un número importante de muestras mensuales. Debemos mejorar la sensibilidad para no perder los pacientes con bacteriemias menores a 102 bacterias/ml.


Palavras-chave:  Leptospirosis, MAT, q-PCR