Resumo

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria gram-positiva causadora da Linfadenite Caseosa (LC), uma doença infecto-contagiosa crônica que acomete pequenos ruminantes, tendo como manifestação clínica a formação de abcessos superficiais e/ou viscerais. Essa patogenia tem ampla distribuição mundial com significativas perdas econômicas. Apesar, das intensas pesquisas laboratoriais, os métodos diagnósticos desenvolvidos demonstraram pouca eficiência na identificação de animais acometidos na fase subclínica da enfermidade. Recentemente, padronizamos um Teste Intradérmico de Hipersensibilidade (TIH) com proteínas secretadas totais (PSTs) de C. pseudotuberculosis com resultados promissores, porém o mesmo requer ajustes relacionados principalmente à seleção de antígenos das PSTs e obtenção desses em larga escala. Em estudos realizados, essas PSTs demonstraram antigenicidade após ELISA e Western Blot com soros de animais infectados, além de induzirem elevada produção de interferon-gamma (IFN−Γ)por células sanguíneas. As PSTs foram também identificadas por espectrometria de massa (104 proteínas) e caracterizadas por análises in silico. Assim, neste trabalho selecionamos os melhores alvos protéicos previamente caracterizados e produzimos as proteínas recombinantes para a elaboração de um TIH mais sensível e específico para a LC. Seis alvos gênicos foram selecionados após análises envolvendo a densidade de epítopos de seus produtos. Os insertos foram amplificados após a extração do DNA genômico da linhagem 1002 de C. pseudotuberculosis com a utilização de iniciadores específicos, ligados no vetor pET−28a e transformados em Escherichia coli para a clonagem molecular. Para verificar a expressão das proteínas recombinantes, os clones foram transformados em Escherichia coli C43 pLysS e a cinética de expressão realizada. Após a indução com 1M de IPTG, as proteínas recombinantes foram purificadas através da técnica de cromatografia por afinidade, quantificadas e caracterizadas quanto à antigenicidade através de ensaios de ELISA, Western Blot blot e dosagem de IFN−Γ. Concluídas essas etapas, esperamos que uma ou mais das seis proteínas recombinantes possam ser utilizadas no desenvolvimento de um TIH de elevada acurácia, para a aplicação no controle da disseminação da doença nos rebanhos de ovinos e caprinos.