A TECNOLOGIA IGY VIABILIZANDO RASTREAMENTOS DA BIBLIOTECA DE CDNA DE PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS: ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE CLONES.

Ana Claudia Paiva Alegre (FMRP-USP); Fausto Bruno dos Reis Almeida (FMRP-USP); Maria Cristina Roque-barreira (FMRP-USP); Ebert Seixas Hanna (FMRP-USP)

Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, micose profunda de maior prevalência na América Latina. Estima-se que o Brasil detenha 80% dos casos de PCM, distribuídos irregularmente em áreas endêmicas, e é provável que seja a oitava causa de óbito por doenças infecto-parasitárias crônicas e recorrentes no país. Uma lectina de P. brasiliensis denominada paracoccina (70kDa), purificada por afinidade a N-acetil glicosamina, foi identificada e localizada na superfície celular. O objetivo do nosso trabalho é a identificação de moléculas presentes em uma fração purificada por cromatografia de afinidade a quitina, e uma dessas moléculas é a paracoccina, proteína multi-funcional, que apresenta atividades lectínica e enzimática (NAGase), e contribui para a adesão do fungo à matriz extracelular e induz macrófagos a produzirem TNF-α e altas concentrações de NO. O procedimento de purificação utilizando cromatografia de afinidade em coluna de quitina proporciona rendimento final de 5μg, cuja análise SDS-PAGE 12% revelou banda de aproximadamente 70kDa, correspondente a paracoccina. A coleção desse material foi necessária para a produção de anticorpos IgY, utilizados para rastreamento da biblioteca de cDNA de leveduras de P.brasiliensis em conjunto com análises proteômicas realizadas no Centro de Pesquisa em Câncer Fred Hutchinson, em Seattle (EUA), onde a identificação das proteínas foi realizada através da digestão tríptica in-solution de alíquotas liofilizadas das preparações de paracoccina. A tecnologia IgY permitiu o isolamento de clones que foram selecionados para o seqüenciamento. Nossos resultados indicaram que as preparações de paracoccina contêm outros elementos além da clássica banda de 70kDa, e destacaram o gene PADG_3347. Esse gene está relacionado com a expressão de uma proteína hipotética de P. brasiliensis, e possui sequencia traduzida homóloga às proteínas multifuncionais, com domínios atribuídos às funções lectínicas e enzimáticas. Esse resultado corrobora com o fato de que as preparações de paracoccina são purificadas por afinidade, devido a sua atividade lectínica, mas também possuem atividade enzimática comprovada, da classe das N-acetil-glucosaminidases. Instituição de fomento: Capes e Fapesp