CLONAGEM, EXPRESSÃO HETERÓLOGA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM GENE DE LACASE DE PYCNOPORUS SANGUINEUS

Priscila da Silva Lima (UnB); Carlos Roberto Félix (UnB); Eliane Ferreira Noronha (UnB)

  Lacases são enzimas de ampla aplicação biotecnológica, como na remoção de lignina da polpa de celulose e biorremediação de compostos fenólicos de indústrias farmacêuticas e têxteis. Em um estudo iniciado por Garcia e colaboradores (2006), o fungo filamentoso Pycnoporus sanguineus foi descrito como produtor de lacases aplicadas no tratamento de efluentes fenólicos industriais. Dando continuidade a este estudo, um gene de lacase de P. sanguineus foi isolado, clonado e expresso na levedura metilotrófica Pichia pastoris, visando a produção desta enzima em larga escala para aplicação na biorremediação de efluentes fenólicos industriais, assim como, no branqueamento de papel e delignificação de biomassa lignocelulósica para produção de bioetanol. O cDNA da lacase foi obtido através de uma reação de RT-PCR utilizando “primes” específicos desenhados com base na seqüência de uma lacase de P. sanguineus depositada no banco de dados de seqüências no Genbank. Como produto da RT-PCR foi amplificado um segmento de DNA com 1500 pb. O cDNA foi, clonado no vetor PGEM-T e utilizado na transformação de células de Escherichia coli, sendo obtidos 18 clones positivos. Destes o clone denominado PGLac 1 foi utilizado para a obtenção das construções 1 e 2. Na construção1 o inserto obtido na clonagem em pGEM-T foi subclonado em pPICZαA e utilizado na transformação de Pichia pastoris. Para esta construção, não foram detectados clones de P. pastoris produtores de lacases. Na construção 2, o cDNA foi subclonado utilizando-se o vetor de expressão pPIC9. Em seguida, foi realizada a transformação de P. pastoris GS115. Os transformantes foram plaqueados em meio seletivo sólido (MD) contendo o substrato AzBTS, sendo observados clones com a atividade enzimática de interesse. O cDNA clonado no vetor pPICZαA10 foi seqüenciado. A seqüência obtida apresentou identidade de 97% com as lacases de P. sanguineus e P. cinnabarinus e 79% com uma lacase de Trametes sp. Além disto, a seqüência protéica predita possui 502 aminoácidos, 3 domínios conservados de cobre-oxidases, massa molecular de 58,8 KDa e ponto isoelétrico de 5,7. A seqüência predita foi modelada utilizando-se a ferramenta SPDBV, tendo como base a estrutura de uma lacase de C. cinereus. A lacase heteróloga tem 57%  de identidade com a seqüência molde e uma estrutura semelhante a de outras lacases de fungos da podridão branca.