AVALIAÇÃO DO LIMITE DE DETECÇÃO DA PCR E ANÁLISE DE POLIMORFISMO DE FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES CAUSADORES DE FUNGEMIA EM AMOSTRA BIOLÓGICA.

Ana Karla Lima Freire (PPGMT/UEA-FMTAM); Ivanete de Lima Sampaio (PPGMT/UEA-FMTAM); Mirlane Silva dos Santos (UNINORTE); Érica Simplício da Silva (ULBRA); João Vicente Braga de Souza (INPA)

Introdução: As fungemias representam importante causa de morbimortalidade em pacientes imunocomprometidos. A identificação molecular tem se mostrado de grande utilidade na prática laboratorial. É uma ferramenta sensível e específica para o diagnóstico precoce das micoses oportunistas e auxilia na escolha de terapêutica eficaz. Objetivos: Avaliar o limite de detecção da reação de cadeia de polimerase e análise de polimorfismo de fragmento de restrição para identificação de agentes causadores de fungemia em amostra de sangue. Especificamente pretendeu-se: a) determinar a concentração necessária de células/mL para a PCR e b) avaliar os perfis de RFLP gerados pelos microrganismos. Metodologia: Os agentes patogênicos (Cryptoccocus neoformans FMT125, Candida albicans FMT457 e Histoplasma capsulatum FMT046) foram selecionados da coleção de fungos da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. Amostras de sangue foram contaminadas com diferentes concentrações de células dos microrganismos estudados (10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³ e 10²/mL). A extração do DNA (200 µL de sangue) foi realizada utilizando-se o sistema comercial de extração DNeasy® Blood & Tissue Kit (QIAGEN Group- DU® - Beckman Instruments, Inc.). A reação de cadeia de polimerase foi feita utilizando-se o par de primers ITS5 e NL4, que foram desenhados para amplificar as regiões do espaçamento interno do rDNA, sendo esta uma região semi-conservada destes agentes etiológicos. A digestão dos produtos de PCR foi realizada com 10U da enzima de restrição Ddel por 12 horas a 37 ^oC. Resultados: A concentração mínima para a amplificação de C. neoformans e H. capsulatum foi de 10⁴/mL células enquanto para C. albicans foram necessárias 10⁵ células/mL. A enzima Ddel que gerou os seguintes perfis de RFLP: 450, 400, 225 e 200 pb (C. albicans); 550, 425, 100 pb (C. neoformans) e 475, 425, 300, 100 e 50 pb (H. capsulatum).