PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS PARA A DETECÇÃO DA FITOQUELATINA SINTÉTICA EC20 ANCORADA À SUPERFÍCIE CELULAR DE MICRORGANISMOS RECOMBINANTES

Carolina Angélica da Silva Parada (USP); Cleide Barbieri de Souza Pereira (USP); Ronaldo Biondo (USP); Maria Elisabete Sbrogio-almeida (IBu); Alexandre Pereira (IBu); Leandro Mantovani de Castro (USP); Emer Suavinho Ferro (USP); Ana Clara Guerrini Schenberg (USP); Elisabete José Vicente (USP)

As fitoquelatinas são proteínas ricas em ácido glutâmico, cisteína e glicina e podem ser encontradas em algas, fungos e plantas. A cisteína é um aminoácido que possui grupos sulfidril com alta afinidade por metais, conferindo às fitoquelatinas a capacidade de ligação com íons metálicos. Estudos posteriores demonstraram genes sintéticos codificando pequenos peptídeos análogos às fitoquelatinas, porém com seqüência primária baseada apenas nas repetições (Glu-Cys)nGlys, sendo n=20 e com a ligação gama entre os aminoácidos Glu e Cys substituída por uma ligação alfa. Essas modificações resultaram numa proteína queladora de metais pesados de alta eficiência que vem sendo ancorada à superfície celular de microrganismos recombinantes desenvolvidos por nosso grupo, fornecendo-lhes a capacidade de atuar como bioadsorventes de metais pesados em águas contaminadas.O presente trabalho tem como objetivo purificar a fitoquelatina sintética EC20 e produzir anticorpo contra esta proteína para a sua detecção na superfície celular desses microrganismos biorremediadores. Para a obtenção do gene sintético que codifica a EC20 foram desenhados dois oligonucleotídeos que se complementam parcialmente e, após a construção da fita dupla de DNA, este fragmento foi inserido no vetor de expressão pGEX4T-2. A produção de anticorpos policlonais foi realizada com a fitoquelatina sintética fusionada à GST purificada por cromatografia de afinidade. A proteína purificada foi injetada subcutaneamente em coelhos New Zealand White. Depois de 40 dias, foi realizada uma segunda imunização. Após coleta de soro sanguíneo, os anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade e utilizados para a detecção da EC20 ancorada à superfície de microrganismos recombinantes através de ensaios de Western Blotting e Microscopia de Fluorescência. A EC20 foi capaz de gerar resposta imunológica de baixa intensidade, porém suficiente para permitir a sua detecção em ensaios imunoenzimáticos. Devido ao grande número de cisteínas em sua estrutura, a EC20 foi purificada e inoculada em condições desnaturantes o que não impediu a capacidade de reconhecimento da proteína renaturada pelos anticorpos produzidos.