AVALIAÇÃO DA REPRODUTIBILIDADE NA DETERMINAÇÃO DO "CUT-OFF" DE UM PROTÓTIPO DE KIT PARA DETECÇÃO DE DNA DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS UTILIZANDO MICROPLACAS

Mirela Verza (FEPPS); Candice Tosi Michelon (FEPPS); Natália Machado Nunes (FEPPS); Leonides Rezende (Ampligenix Biotech); Maria Lucia Rosa Rossetti (FEPPS)

Em razão de dificuldades encontradas no diagnóstico laboratorial tradicional da tuberculose (TB), novas técnicas de biologia molecular têm sido propostas como alternativa. Inicialmente, um método colorimétrico in house para a detecção de DNA do complexo Mycobacterium tuberculosis (M. tb) em microplacas foi desenvolvido e os resultados obtidos com amostras pulmonares demonstraram que este método apresentava potencial para um kit comercial. A partir deste modelo in house, a empresa Ampligenix Biotech produziu um protótipo de kit comercial para realizar os estudos de validação. A determinação do valor do ponto de corte ("cut-off") para determinar a positividade de uma amostra é uma das etapas mais importantes neste processo. O objetivo deste trabalho foi determinar o “cut-off" do protótipo para detecção de DNA do complexo M. tb utilizando microplacas. Uma região do DNA do elemento de inserção IS6110 específica do complexo M. tb foi selecionada como alvo para amplificação por PCR. Os produtos amplificados biotinilados foram hibridizados em microplaca. Para a detecção colorimétrica o conjugado estreptavidina-peroxidase foi utilizado juntamente com o substrato TMB. O resultado dessa reação de cor foi quantificado em espectrofotômetro. Para o cálculo do "cut-off" pelo método in house foram utilizadas 120 amostras pulmonares e extrapulmonares negativas para TB na baciloscopia e na cultura. Estas mesmas amostras foram utilizadas para determinar o valor do cut-off com o protótipo do kit produzido empresa Ampligenix Biotech. O resultado do "cut-off" pelo método in house foi estabelecido em 0,250 (média das absorbâncias somadas de 3 desvios padrão). O valor do "cut-off" do protótipo do kit comercial apresentou excelente reprodutibilidade, pois também foi estabelecido em 0,250. Outros estudos serão realizados para avaliar a estabilidade do protótipo do kit bem como a validação em laboratórios de rotina. Fomento: CNPq, FEPPS, Ampligenix Biotech.