25º Congresso Brasileiro de Microbiologia

APLICAÇAO DA TECNOLOGIA DE CROMATOGRAFIA DESNATURANTE DE ALTO DESEMPENHO (DHPLC) NO CONHECIMENTO DA DIVERSIDADE BACTERIANA ENDOFÍTICA DURANTE O PROCESSO INICIAL DE FERMENTAÇAO DA MANDIOCA (MANIHOT SP.)

Cintia Kodama (UFPA); Paulo Roberto Miranda (UFPA); Cinthia Bandeira (UFPA); Alberdan Santos (UFPA); Maria Paula Schneider (UFPA); Sara Cuadros Orellana (UFPA); Artur Silva (UFPA)

Neste trabalho, avaliou-se o uso da técnica de Denaturing High Performance Liquid Cromatography (DHPLC) para o estudo da diversidade microbiana durante a fermentaçao de mandioca (Manihot sp.). Raízes de mandioca previamente submetidas a assepsia superficial foram mantidas submersas em água destilada, na razão 1:2 m/v, por 7 dias a temperatura de 28ºC. A cada 12 horas, alíquotas do fermentado foram filtradas e congeladas em tampão NaCl 1M, Tris-Cl 1M e EDTA 100mM para preservação do DNA. O gene do 16S rRNA foi amplificado dessas amostras, usando os primers 8F e 1407R, e uma segunda reação de amplificação que cobria um fragmento de aproximadamente 194-pb da região V3 do 16S rRNA foi realizada com o objetivo de adicionar um grampo GC ao amplicon. A separação dos amplicons foi realizada por DHPLC, e as frações coletadas foram tratadas de duas maneiras. Na primeira, as amostras foram submetidas a uma nova amplificação para retirar os grampos GC antes de serem clonadas e sequenciadas. Na segunda estratégia, o produto de coleta foi clonado e sequenciado diretamente. Com a primeira abordagem, foram obtidas 132 sequencias, 45% das quais relacionam-se a bactérias ambientais, não cultiváveis e não classificadas em nenhum filo reconhecido. Na segunda abordagem, foram obtidas 193 seqüências cuja abundância relativa de filos calculada mostra a predominância de microorganismos pertencentes à famíia Proteobacteria (48%), além de bactérias não cultiváveis e não classificadas (40%) e bactérias do filo Firmicutes pertencentes à classe Clostridia (12%). O filo de maior predominância encontrado no decorrer do processo de fermentação da mandioca foi a das proteobactérias, e a família de maior abundância foi a Enterobacteriaceae. O segundo filo classificado de maior abundância foi o Firmicutes. Por outro lado, os filos Bacteroidetes e Actinobacteria não mostraram uma representação tão acentuada. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira vez que essa abordagem é utilizada para o estudo da diversidade microbiana envolvida em um processo fermentativo. O DHPLC permitiu detectar uma vasta diversidade microbiana associada à fermentação da mandioca e mostrou ser um método pouco laborioso, rápido e eficaz, que representa uma alternativa interessante para a identificação e monitoramento de populações microbianas.