| Área: Genética e Biologia Molecular ( Divisão N ) EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DA SEPTINA CDC12 DE PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS Thaila Reis (FMRP-USP); Paulo Coelho (FMRP-USP)
ResumoAs septinas costituem uma família de proteínas conservadas de fungos a mamíferos. Esta família de proteínas organiza-se estruturalmente formando complexos hetero-oligoméricos e se associam em filamentos na periferia celular. Septinas são caracterizadas pela presença de um domínio de ligação a GTP na região central e um domínio coiled-coil na extremidade C-terminal. No fungo leveduriforme Saccharomyces cerevisiae, as septinas desempenham função em diversos processos como citocinese, esporulação, ciclo celular e morfogênese. Neste trabalho nós identificamos uma septina do fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis, clonamos e expressamos a sequencia codificadora desta proteína, obtivemos a proteína recombinante por expressão heteróloga em Eschericchia coli e a proteína pura foi utilizada para a produção de anticorpos policlonais em coelhos.
Inicialmente, pesquisamos um banco de dados de EST de P. brasiliensis e identificamos um clone de cDNA com alta homologia a genes que codificam para septina Cdc12 em Aspergillus fumigatus e S. cerevisiae (91% e 59% de identidade, respectivamente). A ORF foi amplificada por PCR e clonada no vetor pQE (Qiagen) para expressão em bactéria. Este vetor adiciona uma cauda de 6 histidinas na porção N-terminal da proteína expressa a qual permite a purificação da proteína de fusão por afinidade em resina de níquel. O vetor recombinante foi eletrotransformado em cepas de E. coli M15 e a expressão da proteína foi induzida pela adição de 1mM de IPTG em culturas líquidas. A septina recombinante PbCdc12r foi purificada por afinidade em resina de Ni2+ e injetada em coelhos para a produção de anticorpos. O soro imune foi incubado com Western blot de extrato protéico de hifas e leveduras de P. brasiliensis e reconheceu uma proteína com cerca de 45kDa. A imunolocalização da septina em leveduras e hifas de P. brasiliensis revelou uma marcação preferencial no limite entre célula mãe e célula filha e na região do septo, respectivamente. O anticorpo policlonal contra a septina PbCdc12 representa uma importante ferramenta para o estudo do comportamento e organização desta septina na morfogênse de P. brasiliensis.
Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, septina, expressão heteróloga |