| Área: Genética e Biologia Molecular ( Divisão N ) CLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS-GPI DE PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS
Thaila Reis (FMRP-USP); Elton Vasconcelos (FMRP-USP); Angela Cruz (FMRP-USP); Paulo Coelho (FMRP-USP)
ResumoA parede celular fúngica é uma estrutura dinâmica composta por açúcares e proteínas cuja função é proteger a célula contra estresses ambientais e mecânicos, manter o equilíbrio osmótico e a morfologia celular. Nos fungos, algumas proteínas são expostas na superfície celular por meio de ancoramento por glicosilfosfatidilinositol (GPI). Estas proteínas desempenham uma gama de funções como adesão célula-célula, célula-tecido, além de participarem da biogênese e remodelamento da parede de celular. Caracteristicamente, as proteínas-GPI podem apresentar uma alta porcentagem de resíduos de serina e treonina que passam por modificações pós-traducionais do tipo O-glicosilação. A composição complexa incluindo moléculas antigênicas e pelo fato de representar a primeira barreira de interação entre o fungo e a célula hospedeira fazem da parede celular é um importante alvo de estudos para desenvolvimento de drogas e vacinas.
Neste cenário, o objetivo do nosso trabalho é identificar GPIp do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis e avaliar a atividade protetora dessas proteínas em sistema de infecção em modelo animal.
Através da análise de bioinformática comparativa identificamos 34 ORFs de Paracoccidioides brasiliensis com características de proteínas-GPI. Até o momento, analisamos a expressão por tempo real de 11 dessas ORFs das quais 5 são preferencialmente expressas em hifas, 3 em leveduras e 3 não apresentam expressão diferencial estatisticamente significante. 9 ORFs foram clonadas em vetores de expressão pela tecnologia do sistema Gateway® e destas, 5 estão expressas em sistema heterólogo de Saccharomyces cerevisiae. Quanto à purificação, uma proteína sem função descrita (PADG_00497.1) expressa em fusão N-terminal com GST foi purificada em resina de glutationa sefarose, entretanto, seu potencial imunogênico ainda não foi testado. Em relação as modificações pós-traducionais detectamos uma variação de 12 a 35% de resíduos de S/T com sítios potenciais para glicosilação do tipo O (média de18.2%).
Pretendemos com este trabalho contribuir para a descoberta de proteínas imunogênicas de P. brasiliensis que possam abrir novos caminhos no desenvolvimento de vacinas e drogas contra a paracoccidioidomicose.
Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, proteínas-GPI, expressão heteróloga |