SELEÇÃO DE MUTANTES DE GLUCONACETOBACTER DIAZOTROPHICUS DEFECTIVOS NA SÍNTESE DE ÁCIDOS ORGÂNICOS

Marcia Soares Vidal (Embrapa Agrobiologia); Cleiton de Paula Soares (UFRJ); Sandra Maria Andrade Fernandes (UNIG); Renata Jorge da Silva (UFRRJ); Kátia Regina dos Santos Teixeira (Embrapa Agrobiologia)

A capacidade de Gluconacetobacter  diazotrophicus produzir ácidos orgânicos (AOs), derivados da oxidação incompleta da glicose inclusive em condições de fixação de nitrogênio, representa uma das suas potenciais aplicações biotecnológicas; no entanto, para garantir a eficiência desses processos biológicos é necessário entender os mecanismos envolvidos e a influência de fatores externos sobre a regulação da expressão gênica em ambos processos. Diante disso, o presente trabalho buscou a geração e seleção de mutantes aleatórios de G. diazotrophicus com fenótipo alterado para a biossíntese de AOs. Três mil mutantes aleatórios gerados pela inserção do transposon Tn5 no DNA da estirpe selvagem PAL5^T foram avaliados fenotipicamente em meio de cultivo P1 suplementado com glicose e ácido glicônico. Durante esta avaliação foram selecionados 24 mutantes cujo comportamento no meio seletivo mostrou-se alterado quando comparado com PAL5^T, seja pela ausência de um halo característico para acidificação do meio, seja pela ausência de pigmentação indicando alterações na produção de ácidos glicônicos ou seus cetoderivados (os ácidos 2-cetoglicônico, 5-cetoglicônico ou 2,5-dicetoglicônico). Para comprovar o envolvimento da interrupção gênica com a produção de fenótipos alterados e sua relação com a produção de ácidos orgânicos foi realizada a identificação do sítio de inserção do Tn5 pelas metodologias de PCR invertido e sequenciamento. A caracterização de alguns mutantes revelou inserções em diversas regiões do genoma de G. diazotrophicus, algumas delas não envolvidas diretamente no processo de fermentação oxidativa. Contudo, outros mutantes apresentaram inserções em genes envolvidos na cadeia respiratória e no metabolismo direto de glicose à ácido glicônico. Nos mutantes K314 e K416 a mutação ocorreu no gene da glicose desidrogenase com pirroloquinolina quinona, enzima chave no processo de transformação da glicose a ácido glicônico em Gluconobacter oxydans e outros microrganismos. Em outros 5 mutantes a inserção ocorreu no gene que codifica uma subunidade da proteína NADH:quinone redutase, enzima associada a membrana de G. diazotrophicus e envolvida na cadeia de respiração dessa bactéria. Estudos relacionados a capacidade de produção do ácido glicônico e de seus cetoderivados pelos mutantes indicarão o envolvimento dessas proteínas neste processo em G. diazotrophicus.
Fontes financiadoras: Embrapa- MP3 Processo No. 03.06.09.013.00; Pronex-FAPERj Processo No. E.26/171.523/2006; CNPq/Processo No: 552820/2007-5