RAPD-PCR E CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE NOVAS CEPAS DE BACILLUS THURINGIENSIS

Gabriela Cristina Alles (UNISINOS); Vilmar Machado (UCS); Lidia Mariana Fiuza (UNISINOS)

O entomopatógeno, Bacillus thuringiensis, caracteriza-se pela produção de inclusão cristalina na célula mãe, durante sua esporulação, a qual contém delta-endotoxinas ativas a diversas ordens de insetos. Atualmente, técnicas moleculares, aliadas aos métodos bioquímicos tradicionais, têm sido utilizadas como ferramentas auxiliares na taxonomia microbiana. As técnicas de RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA) e análise de proteínas que constituem os cristais (SDS-PAGE) têm sido utilizadas como marcadores genéticos. Esse estudo objetivou caracterizar, através de métodos moleculares, novas estirpes de B. thuringiensis com atividade tóxica para Spodoptera frugiperda. Neste estudo foram utilizadas 15 cepas de B. thuringiensis pertencentes ao Banco de Bactérias Entomopatogências da UNISINOS, com atividade tóxica para Spodoptera frugiperda. Na análise por RAPD-PCR foram  utilizados 6 primers com sequência arbitrária de 10pb e a análise dos perfis foram efetuadas em gel de agarose a 1,5%. As análises de SDS-PAGE foram realizadas por eletroforese, em gel a 10%, sendo a concentração determinada pelo método Bradford. Os resultados foram transformados em matrizes binárias e submetidos ao programa NTSYS-pc (versão 2.1). Como resultados, nas análises de perfil protéico, 10 cepas foram similares à estirpe entomotóxica Bacillus thuringiensis sorovar israelensis. Com base nos fragmentos amplificados, gerados pelo RAPD-PCR, para cada um dos seis iniciadores foi possível discriminar as estirpes tóxicas, corroborando com os resultados obtidos pelo perfil protéico através do SDS-PAGE. Todos os amplicons produzidos pelas estirpes para cada iniciador, apresentaram-se idênticos à cepa de referência B. thuringiensis sorovar israelensis. O RAPD-PCR é um método altamente discriminativo para diferenciar estirpes, ao comparar os perfis obtidos às diferentes linhagens ou espécies, é possível detectar-se fragmentos diferenciais específicos para a espécie de interesse, mas ausente em outras espécies relacionadas. Com base nos resultados obtidos no presente estudo, a combinação das metodologias de RAPD-PCR e SDS-PAGE pode representar uma alternativa para avaliar novos isolados de B. thuringiensis e, deste modo, contribuir para o aprimoramento do conhecimento de diferenças intra-específicas dessa importante e útil espécie bacteriana.