FRAGMENTOS DE ANTICORPOS RECOMBINANTES (SCFV) PARA A DETECÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE CORONAVÍRUS AVIÁRIOS

Montassier H.j. H.j. (UNESP - Jaboticabal); Caetano A.g. Aline G. (UNESP - Jaboticabal); Fernandes C.f. Camila C. (UNESP - Jaboticabal); Montassier M.f.s. Maria de Fatima S. (UNESP - Jaboticabal); Gonçalves M.c.m. Mariana C. M. (UNESP - Jaboticabal); Gibertoni A.m. Aliandra M. (UNESP - Jaboticabal)

A bronquite infecciosa se destaca entre as coronaviroses aviárias por ser uma doença viral que vem causando grandes prejuízos às criações avícolas. Com base na tecnologia de apresentação de proteínas em bacteriófagos (Phage display) foi construída uma biblioteca de fragmentos de anticorpos recombinantes, como cadeia única de região variável (scFv) derivada do RNAm do baço de galinhas imunizadas com a estirpe H120 do vírus da bronquite infecciosa (VBI), que é um membro do grupo III da Família Coronaviridae. Os genes codificadores das regiões variáveis de cadeia leve (VL) e pesada (VH) foram amplificados, por RT-PCR e foram unidos por seqüência nucleotídica linker por PCR-overlap e clonadas em fagomídeo pCANTAB 5E. Após 3 ciclos de "panning", 10 anticorpos recombinantes scFv com reatividade para o VBI foram expressos em fagos por 10 clones. A análise por Western-blotting desses anticorpos revelou que 9 reagiam com a proteína de nucleocapsídeo (N) e apenas um deles reagia com a subunidade 1 da glicoproteína de espícula (S1) do VBI. Desses clones, foram selecionados dois; um deles expressando o anticorpo recombinante com maior reatividade para a proteína N e o outro o anticorpo anti-S1, para que as suas seqüências gênicas VH-linker-VL fossem subclonadas em vetor pET 28a e utilizadas para a transformação de E. coli BL21. As formas solúveis desses anticorpos recombinantes foram obtidas, sendo que o scFv anti-S1 demonstrou atividade neutralizante contra a estirpe do sorotipo homólogo do VBI (estirpe M41) e foi capaz de discriminar no ELISA as estirpes desse sorotipo daquelas pertencentes a sorotipos heterólogos, enquanto que a forma solúvel do anticorpo scFv anti-N reagiu com elevada intensidade com todas as estirpes do VBI testadas; tanto homólogas como heterólogas. Esses mesmos anticorpos recombinantes anti-S1 e anti-N foram também empregados de forma bem sucedida na técnica de imunoperoxidase para a detecção de antígenos virais em amostras teciduais colhidas de aves infectadas. Concluindo, os anticorpos scFv anti-VBI produzidos nesse estudo podem ser usados de forma efetiva em diversas técnicas de imunodiagnóstico do VBI, destinadas à detecção ou a diferenciação de estirpes variantes desse vírus.