CLONAGEM, EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E ESTABILIDADE DE PSAA (PNEUMOCOCCAL SURFACE ADHESIN A) RECOMBINANTE PARA DESENVOLVIMENTO DE VACINA PROTEICA CONTRA STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

Ana Paula Correa Argondizzo (Fiocruz); Ariane Leites Larentis (Fiocruz); Ana Carolina Magalhaes Andrade de Góes (Fiocruz); Júlia Fabiana Monteiro Quintal Nicolau (Fiocruz); Ellen Jessouroun (Fiocruz); Marco Alberto Medeiros (Fiocruz)

A produção de uma vacina contra S.pneumoniae, um dos principais causadores de morte em todo o mundo, é uma das prioridades do Ministério da Saúde e da FIOCRUZ/Bio-Manguinhos. O desenvolvimento de uma vacina proteica é uma alternativa às vacinas compostas por polissacarídeos capsulares e conjugadas, que não apresentam cobertura necessária para os sorotipos prevalentes no Brasil. Uma das proteínas em estudo para esta vacina (como antígeno vacinal, combinada a polissacarídeos ou como carreadora em vacinas conjugadas) é a PsaA, proteína de superfície e conservada em diferentes sorotipos. A PsaA foi clonada em pET28a e expressa em E.coli BL21(DE3)Star, com marcador de resistência à canamicina e sem cauda de fusão, visando seu emprego em vacinas para uso humano. O crescimento da bactéria em frascos a 200rpm foi medido por absorbância (600nm) e a expressão avaliada em SDS-PAGE 12,5% com Coomassie Blue R-250, empregando padrão de proteína para avaliação da intensidade das bandas por densitometria (GS-800 Calibrated Densitometer Bio-Rad e programa QuantityOne 4.4.1). A proteína foi expressa em altos níveis (na faixa de 800-1000mg/L e erros experimentais de 10%), com suas condições de indução (temperatura, concentração de indutor, tempo pós-indução, meio de cultura) otimizadas através do emprego das técnicas de planejamento experimental visando à obtenção de maior quantidade de proteína solúvel para purificação posterior. Foi verificado que a produtividade da PsaA recombinante (mg/L por hora) mantém-se com longos tempos de cultivo, indicando que a expressão pode ser implementada por 16h a 25°C, permitindo maior obtenção de biomassa. Foi possível reduzir a concentração de indutor em 10 vezes (para 0,1mM) sem redução dos níveis de expressão, tanto em TB quanto LB. A proteína recombinante foi purificada na fração solúvel em HPLC usando matriz de troca iônica (DEAE FF), com grau significativo de homogeneidade. A estabilidade da proteína foi confirmada após armazenamento por mais de 1 ano, tanto em 4°C quanto em -70°C (em PBS e com glicerol 10% e sacarose 10% como crioprotetores), confirmando sua potencialidade para emprego como insumo na área de saúde. A antigenicidade da proteína recombinante PsaA foi comparável à proteína nativa de S.pneumoniae. Estes dados indicam o potencial de aplicação desta proteína para o desenvolvimento de uma vacina proteica contra pneumococos.