CLONAGEM, EXPRESSÃO DE CLPP PROTEASE DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE EM ESCHERICHIA COLI E AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA REDUÇÃO DE IPTG E CANAMICINA POR PLANEJAMENTO FATORIAL

Karen Einsfeldt (PEQ/COPPE - UFRJ); Ana Paula Corrêa Argondizzo (FIOCRUZ); Marco Alberto Medeiros (FIOCRUZ); Tito Lívio Moitinho Alves (PEQ/COPPE - UFRJ); Rodrigo Volcan Almeida (Bioquímica-IQ/UFRJ); Ariane Leites Larentis (FIOCRUZ)

Infecções causadas por S. pneumoniae estão entre as principais causas de morte em todo o mundo. As vacinas disponíveis contra S. pneumoniae, compostas por polissacarídeos capsulares, apresentam alto custo, eficácia limitada em crianças, imunocomprometidos e idosos, e não abrangem alguns sorotipos prevalentes no Brasil. Como alternativa, tem sido investigado o desenvolvimento de uma vacina composta por proteínas associadas à virulência e presentes nos diversos sorotipos da bactéria. Considerando que um destes potenciais antígenos, com alto nível de prevalência e conservação, é a proteína de choque térmico ClpP, o objetivo deste trabalho foi clonar e expressar esta proteína em E. coli e otimizar sua produção através da utilização de planejamento fatorial a dois níveis de duas variáveis (2²). O gene amplificado a partir do sorotipo 14 foi clonado no vetor pET28(b), e expresso em E. coli BL21 (DE3) Star. As variáveis avaliadas pelo planejamento foram concentração de IPTG e canamicina, com réplicas no ponto central. Para tanto, a bactéria recombinante foi cultivada em frascos agitados a 37°C e 200rpm em LB (Triptona 10g/L, Extrato de levedura 5g/L e NaCl 5g/L, pH7,0) enriquecido com 1% de glicose, 0,4% de glicerol  e variando a concentração de canamicina de 0 a 50μg/mL. A indução com IPTG foi feita por 4h a partir da fase exponencial de crescimento (com absorbância 600nm entre 0,65 e 0,75), variando entre 0,1mM e 1mM. O crescimento em cada condição do planejamento foi medido por absorbância a 600nm e a expressão foi avaliada em SDS-PAGE 12,5% corado com Coomassie Blue R-250, empregando curva com diferentes concentrações de proteínas padrão para confirmação da intensidade das bandas por densitometria (GS-800 Calibrated Densitometer Bio-Rad e programa QuantityOne 4.4.1). As análises estatísticas foram feitas através do programa STATISTICA 6.1, considerando significativos os efeitos das variáveis com p<0,1. A proteína foi expressa em concentrações similares (250 mg/L) em todos os experimentos, com erros inferiores a 15%. As concentrações de IPTG e canamicina não apresentaram influência significativa na expressão da proteína. Apenas o IPTG apresentou efeito negativo sobre o crescimento. Isto indica que é possível diminuir em 10 vezes a concentração de indutor e retirar o antibiótico do sistema, reduzindo custos e mantendo a expressão em níveis similares.