PADRONIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES PARA MANUTENÇÃO DE ISOLADOS DO FUNGO PATOGÊNICO PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIES POR CRIOPRESERVAÇÃO

Carolina Santos de Oliveira (UFMG); Rosana de Carvalho Cruz (UFMG); Silvia Maria |cordeiro Werneck (UFMG); Patrícia Silva Cisalpino (UFMG)

Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da paracoccidiodomicose (PCM), é um fungo termodimórfico que cresce na forma filamentosa à 25ºC e leveduriforme à 37ºC. A manutenção usual das coleções de isolados de P. brasiliensis se dá por meio de repiques bimestrais para micélio e quinzenais para leveduras, em “Yeast Peptone Dextrose” (peptona de caseína 0.5%, extrato de levedura 0.5%, glicose 1.5%, ágar 1.5% - YPD). A fim de viabilizar a estocagem substituindo os repiques sucessivos, o objetivo deste trabalho é padronizar as condições para a manutenção de isolados de P. brasiliensis por criopreservação, mantendo-se a viabilidade quando requerido o seu cultivo. Cultivos de diferentes isolados de P. brasiliensis foram testados para criopreservação em dois meios: YPD e GYMP (glicose 2%, extrato de levedura 0.5%, extrato de malte 1%, NaH₂PO₄ 0.2%, ágar 2%). Para o meio YPD os isolados Pb B339, 1017, Pinguim e Pb01 (Paracoccidioides lutzii) foram cultivados, sob agitação, à 37ºC, em 50 mL de caldo YPD por 7 dias. Deste cultivo, 1 mL de cada isolado foi armazenada à -76ºC em  tubos criogênicos contendo 50% ou 20% de glicerol. Foram descongelados em intervalos de 30, 45, 75, 120 e 180 dias e seu conteúdo semeado em duplicata em placas de YPD, incubadas à 37ºC durante 15 – 20 dias. Para testar o meio GYMP, foram cultivados os isolados Pb01, Pb18, 608 e tatu, à 37ºC, sob agitação por 7 dias, em 50 mL de caldo, sendo armazenados com 20% de glicerol e descongelados nas mesmas condições apresentadas para YPD. Nenhum dos isolados provenientes do meio YPD foi recuperado após o descongelamento.  Para os isolados oriundos do meio GYMP, contudo, Pb18 cresceu até 75 dias e Pb01 até 120 dias após o descongelamento (180 dias ainda em andamento). Esses resultados sugerem que o isolado Pb01 consegue resistir mais a criopreservação nas condições apresentadas. No momento realizam-se alterações para otimizar a recuperação dos isolados, avaliando-se a viabilidade das células antes do congelamento por meio do uso de corante vital Janus green, incubando-se as placas após descongelamento e semeadura também à temperatura ambiente, e testando-se o dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotetor. Incluíram-se também nos experimentos os isolados 1578 e Ed01 (do grupo P. lutzii), para verificar se sua recuperação ocorreria da mesma forma que a de Pb01