DETECÇÃO DE EPÍTOPOS NA PROTEÍNA M RECOMBINANTE DE HISTOPLASMA CAPSULATUM  ATRAVÉS DA TÉCNICA DE SPOT SYNTHESIS

Claudia Vera Pizzini (IPEC/Fiocruz); Marcos de Abreu Almeida (IPEC/Fiocruz); Thatiane Santos de Simone (IOC/Fiocruz); Herbert Leonel Matos Guedes (IOC/Fiocruz); Salvatore Giovanni de Simone (IOC/Fiocruz); Rosely Maria Zancopé Oliveira (IPEC/Fiocruz)

O diagnóstico clínico da histoplasmose baseia-se nos aspectos clínicos, radiológicos, epidemiológicos e laboratoriais. A confirmação do diagnóstico se dá pelo isolamento e identificação do H. capsulatum através de procedimentos microbiológicos. Entretanto, na ausência dos mesmos, a sorologia apresenta-se como um instrumento vital para o diagnóstico presuntivo da histoplasmose. A histoplasmina, extrato antigênico que tem sido utilizado tanto na avaliação da imunidade celular por testes intradérmicos, bem como da resposta humoral através das reações sorológicas, é composta pela glicoproteína H e a glicoproteína M, antígenos espécie-específicos. No presente estudo buscamos identificar e mapear determinantes antigênicos da proteína M através da técnica de Spot Synthesis, para subseqüente síntese e aplicação em ensaios imunoenzimáticos. Uma biblioteca peptídica cobrindo toda a extensão da proteína M, foi obtida utilizando a técnica F-moc através da metodologia semi-automática de SPOT-SYNTHESIS num sintetizador AutoSpot (modelo ASP222).  O plano de distribuição dos aminoácidos, bem como a determinação dos protocolos para síntese das bibliotecas de peptídeos nas membranas, foram definidos por computação, utilizando o programa Multipeps (Intavis, Alemanha). A detecção dos epítopos antigênicos foi realizada com pool de soros humanos de pacientes com histoplasmose confirmada, e com anticorpo secundário IgG de coelho anti-humana marcada com fosfatase alcalina, a reação foi revelada por quimioluminescência. Foram identificados através desta técnica 20 epítopos primários e 14 epítopos sencundários, os quais por modelo computacional, estão localizados em toda molécula, principalmente nos fragmentos F2 e F3 da proteína M.  A escolha da técnica de Spot-synthesis se deve  ao fato de estar sendo uma das metodologias  mais aplicadas no mapeamento de epitopos. A identificação de epítopos específicos pode auxiliar os estudos imunoquímicos que podem fornecer informações importantes sobre aspectos funcionais de uma molécula e, eventualmente, apresentar informações vitais à engenharia de proteínas e à bioinformática. Os peptídeos gerados também serão úteis no desenvolvimento de métodos de diagnóstico mais sensíveis e específicos.