ANÁLISE E PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS SECRETADAS POR CANDIDA ALBICANS

Elisa Rizzoli (IMPPG); Anna Carolina A.s. Oliveira (IMPPG); Rodrigo Fonseca Souza (IMPPG); Rosangela Maria de Araujo Soares (IMPPG)

A produção e a secreção de proteases por espécies de Candida vêm sendo intensamente estudadas por serem consideradas fatores importantes nas fases da interação fungo-célula hospedeira. As proteases são capazes de digerir proteínas do hospedeiro, invadindo os tecidos através da degradação de proteínas de matriz extracelular e driblando a ação do sistema imune, através da hidrólise de imunoglobulinas e proteínas do sistema complemento. Os estudos de proteases vêm propor o emprego dessas moléculas como alvo potencial de novas drogas antifúngicas e para uso em diagnóstico laboratorial. Foi utilizada Candida albicans (isolado Pri), isolada de uma paciente pediátrica infectada pelo HIV, cultivada em meio BHI líquido. As células foram separadas do sobrenadante através de centrifugação a 3000 rpm/5 min a 3⁰C, e este foi concentrado em AMICON em membrana com 10 kDa. As células foram lavadas e incubadas com PBS (pH 7,2) durante 3 hs/37º C com agitação e em seguida as células foram separadas do sobrenadante condicionado (estresse) e este concentrado por ultrafiltração em membrana com cut-of de 10 kDa. A análise de polipeptídeos secretados no sobrenadante de cultivo em BHI por SDS-PAGE copolimerizado com gelatina demonstrou a presença de pelo menos 10 bandas, variando de 250 kDa a 27 kDa. Entretanto a análise de peptídeos secretados após incubação das leveduras em PBS pH 7,2 por 3 hs revelou bandas variando de 104 kDa a 37 kDa.  A análise de proteases secretadas por C. albicans para o sobrenadante de cultivo em BHI sugerem uma expressão diferencial quando comparada a proteases secretadas sob condição de estresse. Os ensaios com inibidores proteolíticos indicam enzimas pertencentes à classe serina protease, com massas moleculares de 240, 176 e 50 kDa e metalo proteases de 250, 137, 72 e 23 kDa, em ambos os sistemas. A análise por cromatografia em gel filtração de proteases secretadas por leveduras cultivadas em BHI revelou frações enriquecidas com enzimas de 250 kDa e 50 kDa de massa molecular. Apoio: PIBIC/UFRJ, CNPq, FAPERJ.