| Área: Micobacteriologa ( Divisão C ) DETECÇÃO DAS MUTAÇÕES RELACIONADAS COM A RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA E ISONIAZIDA EM ISOLADOS DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS UTILIZANDO MICROPLACAS
Raquel de Abreu Maschmann (UFRGS); Sérgio Ferreira Junior (FEPPS/CDCT); Márcia Susana Nunes Silva (FEPPS/CDCT); Arnaldo Zaha (UFRGS); Maria Lucia Rosa Rossetti (FEPPS/CDCT)
ResumoO aumento da incidência da tuberculose está trazendo sérias consequências à saúde pública. Devido ao recente aumento de resistência aos fármacos utilizados no tratamento, se faz necessária a realização de testes de suscetibilidade aos fármacos em todos os isolados de M. tuberculosis.
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método molecular de hibridização em microplacas para detecção das mutações mais frequentes nos genes rpoB, relacionadas com a resistência à RMP, e nos genes katG e inhA, relacionadas com a resistência à INH, em isolados de M. tuberculosis.
Foi padronizado um PCR multiplex que amplifica regiões dos genes rpoB, katG e inhA, que estão relacionadas com a resistência, juntamente com o elemento de inserção IS6110. Foram desenhadas 15 sondas. Uma para detecção do complexo M. tuberculosis complementar a sequência interna do IS6110, 10 sondas para detectar os genótipos mais frequentes do gene rpoB, cinco com a sequência selvagem e cinco com as mutações mais frequentes, duas sondas do gene katG, uma com genótipo selvagem e outra com a mutação no códon 315 (AGC-ACC) e duas sondas do gene inhA, uma com genótipo selvagem e outra com a mutação na posição -15(C-T). As sondas foram fixadas na microplaca e hibridizadas em fase líquida com os produtos de PCR biotinilados, sendo detectada através da adição do conjugado enzimático estreptavidina-peroxidase, e a reação positiva foi obtida pela adição do seu substrato. O resultado positivo foi visualizado pela reação de cor e quantificado em espectrofotômetro. A caracterização de sensibilidade ou resistência da bactéria foi obtida através do padrão de hibridização da microplaca. O resultado obtido pelo método desenvolvido foi comparado com o sequenciamento.
Foram testadas 24 amostras de DNAs extraídos de culturas de M. tuberculosis. Todas as amostras foram identificadas corretamente como pertencentes ao complexo M. tuberculosis pela hibridização com a sonda do IS6110. Das 24 amostras, 22 (91,7%), 23 (95,8%) e 18 (75%), tiveram suas sequências corretamente identificadas, para o gene inhA, katG e rpoB respectivamente, quando comparadas com o sequenciamento. Para o gene rpoB os problemas de identificação se concentraram na hibridização inespecífica da sonda que identifica a mutação no códon 531 (TCG-TTG). A metodologia mostrou-se promissora na detecção das mutações dos genes em estudo. Um número maior de amostras devem ser testadas e os resultados incongruentes serão repetidos e confirmados.
Intituíção de fomento: CNPq, FEPPS
Palavras-chave: mycobacterium, resistência, rifampicina, isoniazida, microplaca |