| Área: Fermentação e Biotecnologia ( Divisão J ) PURIFICAÇÃO PARCIAL DE UMA B-XILOSIDASE EXTRACELULAR DE PENICILLIUM JANCZEWSKII César Rafael Fanchini Terrasan (UNESP); Eleonora Cano Carmona (UNESP)
Resumob-xilosidases são enzimas do complexo xilanolítico que degradam xilobiose e xilooligosacarídeos com maior grau de polimerização liberando xilose como produto final. Elas são importantes pois finalizam a hidrólise total da xilana, podendo ser aplicadas em diferentes processos industriais nos quais a degradação desse polímero é requerida. As b-xilosidases, bem como outras enzimas desse complexo, apresentam aplicação nas indústrias têxtil, alimentícia, de ração e de polpa e papel. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma metodologia de purificação para uma b-xilosidase extracelular produzida pelo fungo Penicillium janczewskii, linhagem isolada de solo e considerada boa produtora de enzimas xilanolíticas. O cultivo foi realizado em condição estacionária em meio líquido de Vogel suplementado com xilana de aveia 1% (m/v), pH 5,0, a 25 °C por 5 dias, condições previamente estabelecidas como ótimas para produção de β-xilosidases. O sobrenadante obtido, após separação da colônia por filtração, foi utilizado como fonte da enzima. A atividade foi realizada utilizando-se o substrato p-nitrofenil-b-D-xilopiranosídeo em meio tamponado com tampão McIlvaine pH 4,0 a 75 °C. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como correspondendo à liberação de 1mmol de paranitrofenol, por minuto, por mililitro, nas condições de ensaio. A atividade específica foi expressa em unidades de atividade enzimática por miligrama de proteína. A concentração de proteína nas amostras foi determinada pelo método de Lowry, com soroalbumina bovina como padrão. O perfil de eluição de proteínas durante as etapas cromotográficas foi monitorado a 280 nm. PAGE-SDS foi realizado com concentração de poliacrilamida de 8 a 18%. As bandas protéicas foram coradas com coomassie brilliant blue R-250. A massa molecular da enzima nativa foi estimada em cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sephadex G-200.
O filtrado de cultura foi centrifugado (10000 g, 10 min) e as proteínas foram precipitadas com sulfato de amônio. Inicialmente, a precipitação foi realizada nas faixas de 0-30%, 30-60% e 60-90% e, posteriormente, nas faixas de 0-35% 35-55% de saturação. Após precipitação, verificou-se 30% da atividade enzimática na faixa de 0 a 35% de saturação, enquanto que a maior porção (66%) dela se encontrava no sobrenadante de 55% de saturação. Esta amostra foi dialisada exaustivamente contra tampão acetato de amônio 0,05 M pH 6,8, liofilizada e cromatografada em colunas de Sephadex G-100 e Sephadex G-200 equilibradas com o mesmo tampão. Após a terceira etapa de purificação obteve-se recuperação de 10,5% da atividade inicial e um fator de purificação de 1,4. Verificou-se pelo perfil eletroforético, contudo, a presença de outros contaminantes na amostra que deve ser purificada por outras técnicas cromatográficas até homogeneidade. A massa molecular desta proteína estimada por SDS-PAGE e filtração em gel foi de 138,0 e 158,5 kDa, respectivamente.
Palavras-chave: Beta-xilosidase, Penicillium janczewskii, Purificação de enzima |