PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA XILANASE II PRODUZIDA POR PENICILLIUM SCLEROTIORUM

Adriana Knob (UNESP); César Rafael Fanchini Terrasan (UNESP); Eleonora Cano Carmona (UNESP)

b-1,4-D-xilanases são produzidas por uma variedade de microrganismos, incluindo os fungos filamentosos, potentes produtores de enzimas xilanolíticas. Estas enzimas hidrolisam as ligações glicosídicas internas ao longo da cadeia do xilano, liberando xilooligossacarídeos de vários tamanhos, o que resulta em um decréscimo do grau de polimerização do substrato. O interesse em enzimas xilanolíticas tem aumentado consideravelmente nos últimos anos, devido as suas aplicações biotecnológicas, especialmente nas indústrias de papel, de alimentos e de ração animal. Este trabalho teve como objetivo purificar e caracterizar bioquimicamente uma das xilanases (Xil II) extracelulares produzida por Penicillium sclerotiorum. O fungo foi cultivado em meio líquido de Vogel, pH 6,5, a 30 ºC, em condição estacionária por 5 dias. O sobrenadante obtido por filtração foi utilizado como fonte de xilanases. A atividade xilanásica foi determinada utilizando-se uma solução 1 % (m/v) de xilano de vidoeiro em tampão fosfato de sódio 0,05 M pH 6,0, a 50 °C. Após períodos estabelecidos, a determinação de açúcares redutores liberados foi realizada pelo método de Miller (1959), utilizando-se xilose como padrão. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como correspondendo à liberação de 1mmol de açúcar redutor equivalente a xilose, por minuto, por mL de amostra, nas condições de ensaio. As etapas de purificação incluíram uma cromatografia de troca iônica em DEAE Sephadex A-50 equilibrada em tampão Tris-HCl 0,05 M pH 9,0 e uma cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-75, equilibrada em tampão acetato de amônio 0,05 M, pH 6,8. As massas moleculares determinadas por filtração em gel e por PAGE-SDS corresponderam, respectivamente, a 30,8 e 33,1 kDa. A enzima purificada apresentou atividade ótima a 55 ºC e pH ótimo de atividade 4,5. Esta xilanase foi bastante estável de pH 2,5 e 4,5 e apresentou meia-vida de 90 min a 50 ºC. Os agentes redutores b-mercaptoetanol e DTT ativaram a atividade xilanásica, bem como o íon Mn⁺². Contrariamente, os íons Hg⁺² e Cu⁺² e o detergente SDS inibiram fortemente esta atividade. Os valores de K_m para xilano de vidoeiro e xilano de aveia foram 26,61 mg mL^-1 e 23,45 mg mL^-1, respectivamente, enquanto que os valores de V_máx para esses substratos foram 90,25 e 123,68 mmol min^-1 mg^-1 de proteína. A análise dos produtos de hidrólise do xilano de aveia pela ação desta xilanase revelou a presença de xilotriose e de oligossacarídeos superiores.