| Área: Fermentação e Biotecnologia ( Divisão J ) CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE UMA BETA-XILOSIDASE ÁCIDA PRODUZIDA POR PENICILLIUM SCLEROTIORUM
Adriana Knob (UNESP); César Rafael Fanchini Terrasan (UNESP); Eleonora Cano Carmona (UNESP)
ResumoO xilano é o principal componente da hemicelulose, presente na parede das células vegetais. A estrutura do xilano pode diferir grandemente dependendo de sua origem consistindo basicamente de unidades D–xilopiranose, conectadas por ligações beta-1,4, podendo se apresentar de forma linear ou ramificada. A completa e eficiente hidrólise enzimática deste complexo polímero depende principalmente de duas classes de enzimas, as endo beta-1,4 xilanases (EC 3.2.1.8), que hidrolisam as unidades de xilanopiranose da cadeia principal e as beta-xilosidases (EC 3.2.1.37), que hidrolisam a xilobiose e outros xilooligossacarídeos resultantes da ação das endoxilanases. Estas enzimas são amplamente utilizadas pelas indústrias alimentícia, de ração animal, de polpa e celulose. Devido a seu imenso potencial, pesquisas com beta-xilosidases que apresentem propriedades mais adequadas às aplicações industriais vêm sendo realizadas. O objetivo deste trabalho consistiu em determinar as propriedades físico-químicas de uma beta-xilosidase produzida por Penicillium sclerotiorum, a qual foi previamente purificada. As etapas de purificação envolveram a precipitação de proteínas com sulfato de amônio (60% de saturação) e uma cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-100 equilibrada em uma solução tampão de acetato de amônio 0,05 M, pH 6,8. A atividade beta-xilosidásica foi determinada utilizando-se uma solução do substrato sintético p-nitrofenil-beta-D-xilopiranosídeo a 0,25% (m/v) em tampão McIlvaine pH 4,0, conforme descrito por Kersters-Hilderson et al. (1982). Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 micromol de p-nitrofenol por mililitro, a cada minuto de reação. Os ensaios enzimáticos foram realizados em triplicata para a confirmação dos resultados. A enzima purificada apresentou atividade ótima a 60 ºC e pH ótimo de atividade 2,5, um dos mais ácidos já descritos. Esta beta-xilosidase permaneceu estável em ampla faixa de pH de 2,0 a 7,0 e a 60 ºC por 375 min. Todos os cátions divalentes testados, exceto Hg+2, inibiram a atividade beta-xilosidásica, especialmente na concentração 10 mM. A atividade desta enzima também foi sensível aos agentes desnaturantes SDS e EDTA, porém a enzima foi ativada por agentes redutores como DTT e beta-mercaptoetanol. Os valores de Km e Vmáx determinados para o substrato p-nitrofenil-beta-D-xilopiranosídeo foram 0,78 mM e 0,51 mole min-1 mg-1 de proteína, respectivamente. Esta beta-xilosidase apresentou tolerância à xilose, exibindo um KI de 32,1 mM. Por apresentar ótima estabilidade e atividade em pH de extrema acidez, esta nova enzima apresenta potencial para ser empregada pelas indústrias de suco de frutas, de vinho e de ração animal.
Palavras-chave: Beta-xilosidase, Penicillium sclerotiorum, Propriedades físico-químicas, Purificação |