DESENVOLVIMENTO DE FERRAMENTAS GENÉTICAS PARA AZOSPIRILLUM AMAZONENSE

Fernando Hayashi Sant'anna (UFRGS); Dieime de Souza Andrade (UFRGS); Irene Silveira Schrank (UFRGS)

O gênero Azospirillum é reconhecido por compreender espécies bacterianas que promovem o crescimento de vegetais de importância econômica pela produção de fitormônios e pela fixação biológica do nitrogênio. A bactéria A. amazonense possui particularidades em relação a outras espécies do gênero, como a competência de fixar nitrogênio na presença de amônia e a incapacidade de desnitrificar. Ambas caracterísiticas conferem a A. amazonense potencial para ser utilizada como biofertilizante. Entretanto, muito pouco se conhece sobre sua genética, bem como sua fisiologia. Portanto, o desenvolvimento de ferramentas que permitam a  manipulação genética dessa bactéria se tornam relevantes.  O presente trabalho visa estabelecer metodologias de transferência de DNA para A. amazonense, bem como desenvolver vetores para investigação de promotores através de genes-repórteres e vetores para mutagênese sítio-dirigida.
Duas metodologias de transferência gênica foram empregadas: eletrotransformação e conjugação triparental. Para isso, utilizou-se vetores com origens de replicação de amplo espectro pBBR1 e pVS1, com marca de seleção para canamicina. Na análise dos promotores será utilizado como gene-repórter o gene que codifica EYFP (enhanced yellow fluorescent protein). O vetor suicida pSUP202 será utilizado para mediar a mutagênese sítio dirigida dos genes glnB e glnK (envolvidos no metabolismo do nitrogênio).
Inicialmente, o método de transferência de DNA empregado foi o de eletroporação, entretanto, até o momento, não foram obtidos resultados positivos. O método de conjugação triparental foi utilizado e teve resultados satisfatórios. Os vetores mobilizáveis pHRGUSGFP (pBBR1) e pPZPLACEYFP (pVS1), que expressam proteínas fluorescentes,  foram eficientemente transferidos para A. amazonense. Os transconjugantes apresentaram fluorescência, confirmando o sucesso da metodologia. Foram construídos vetores derivados do plasmídeo pPZPLACEYFP contendo o gene eyfp governado pelos promotores dos genes glnB e glnK, respectivamente. Entretanto, não se obteve transconjugantes estáveis à partir dessas construções. A tentativa de mutagênese sítio-dirigida foi realizada com o vetor pSUPKK-GEN, derivado do vetor suicida pSUP202 que contém o gene glnk interrompido por um cassete de resistência ao antibiótico canamicina. Por enquanto, foram obtidos  somente mutantes oriundos de eventos de recombinação simples, pois integraram o vetor ao genoma sem substituírem o gene selvagem.
O método de conjugação com vetores com origens de replicação pVS1 e pBBR1 se mostrou adequado como metodologia de transferência de DNA  para A. amazonense.  Para análise de promotores serão construídos plasmídeos  com origem de replicação pBBR1, já que derivados de pPZPLACEYFP não foram estáveis. Plasmídeos derivados de pSUP202 são boas alternativas para metodologias que necessitem a integração de DNA no genoma de A. amazonense.