ANÁLISE REGULATÓRIA DAS PROTEÍNAS PII NO METABOLISMO DE NITROGÊNIO DA BACTÉRIA DIAZOTRÓFICA AZOSPIRILLUM  AMAZONENSE

Débora Broch Trentini (UFRGS); Fernando Hayashi Sant'anna (UFRGS); Irene Silveira Schrank (UFRGS)

Azospirillum compreende um grupo de microrganismos diazotróficos de vida livre capazes de se associar de forma benéfica com gramíneas economicamente importantes, como cana-de-açúcar e arroz. Em associação, promovem o crescimento vegetal por diversos mecanismos, como produção de fitohormônios, indução da absorção de nutrientes pelas raízes e fixação biológica do nitrogênio. A espécie Azospirillum amazonense se destaca das demais pela tolerância a pHs ácidos e pela capacidade de fixar N na presença de amônia. A fim de estudar o sistema de regulação da fixação e do metabolismo de N de A. amazonense, o presente trabalho propõe caracterizar funcionalmente as proteínas de transdução de sinal PII desta bactéria. Proteínas PII são moléculas sinalizadoras dos níveis celulares de N que atuam pela ligação direta a diversos efetores celulares, como enzimas, transportadores e fatores transcricionais. A indicação da falta de N se dá pela uridilação das proteínas PII pela enzima GlnD. Dois genes parálogos para proteínas PII foram isolados em A. amazonense e classificados como do tipo GlnB e GlnK. Experimentos de RT-PCR demonstraram que ambos genes apresentaram expressão aumentada quando A. amazonense foi mantido em meio desprovido de fonte de N. Essa regulação provavelmente se deve à ativação de promotores σ⁵⁴ associados ao fator transcricional NtrC, cujos sítios de reconhecimento foram mapeados nas regiões regulatórias de ambos os genes. Com o objetivo de investigar os alvos celulares das proteínas PII, estão sendo realizados experimentos de pull-down das formas ativas (uridiladas) e inativas de PII contra extratos de A. amazonense cultivado em condições de limitação e abundância de N, respectivamente. Para tal, as proteínas GlnB e GlnK de A. amazonense, bem como a enzima GlnD de A. brasilense, foram expressas em Escherichia coli BL21 (DE3) fusionadas à cauda de histidina e purificadas em resina de afinidade por níquel. A enzima GlnD será usada para a uridilação in vitro das proteínas PII. A padronização do experimento de pull-down está sendo realizada com a proteína GlnB contra o extrato protéico de A. amazonense referente a condição de abundância de N. As prováveis proteínas de interação obtidas foram separadas por SDS-PAGE e analisadas por LC-MS/MS em um instrumento ESI-QUAD-TOF. Até o momento, apenas uma proteína hipotética foi identificada.