IDENTIFICAÇÃO DE ORFS HIPOTÉTICAS RELACIONADAS A REPARO DE DNA A PARTIR DE BIBLIOTECA GENÔMICA DE CHROMOBACTERIUM VIOLACEUM.

Delanne Cristina Souza Sena (UFRN); Rita de Cassia Barreto da Silva (UFRN); Taís Silveira Ribeiro (UFRN); Lucymara Fassarella Agnez Lima (UFRN)

A finalização dos projetos genomas vem contribuindo com informações que tem possibilitado o desenvolvimento de trabalhos de grande interesse biotecnológico. Porém, o seqüenciamento permite apenas identificar funções de genes por homologia com genes já descritos, ou seja, somente parte das seqüências identificadas possui função conhecida. O seqüenciamento genômico completo da proteobactéria Gram-negativa Chromobacterium violaceum foi publicado em 2003, onde identificou um cromossomo simples circular de 4.751.080bp, 4.431 prováveis genes (janelas aberta de leitura ou ORFs, do inglês Open Reading Frames), apresentando em média de 954 pares de bases (pb) (89%). Análises iniciais mostraram que aproximadamente 40% dessas ORFs são hipotéticas ou hipotéticas conservadas, significando que 40% dos recursos genéticos desta espécie são desconhecidos. Também foi observado que 59 ORFs estão possivelmente relacionadas a reparo de DNA. C. violaceum é uma espécie de vida livre, dessa forma, está constantemente exposta a inúmeros agentes mutagênicos ambientais (por exemplo, radiação UV), então é plausível que muitos outros genes relacionados a proteção ao DNA estejam disponíveis nesta espécie. O objetivo deste trabalho é a identificação de novos genes relacionados ao reparo e integridade do DNA. Foi construída uma biblioteca genômica C. violaceum na cepa de Escherichia coli DH10b (rec A ^-) deficiente na enzima Rec A utilizando o vetor plasmidial pBC. Para a seleção funcional a biblioteca foi submetida à radiação UV (254 nm) objetivando a produção de lesões no DNA, 17 clones resistentes foram selecionados para seqüenciamento e análise do DNA. Essas seqüências foram comparadas com dados não-redundantes no GenBank usando os programas BlastX e tBlastX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e as ORFs foram identificadas usando o programa ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). Além disso, todas as ORFs preditas foram traduzidas e usadas como queries no BlastP. Essas análises identificaram proteínas hipotéticas e hipotéticas conservadas. Alguns domínios conservados também foram identificados, entre eles o da enzima aminodeoxychorismate lyase (ADC lyase) codificada pelo gene pabC. A ORF com o domínio ADC lyase apresentou eficiência no ensaio de complementação funcional usando a cepa DH10b (rec A ^-). Os dados obtidos podem auxiliar na compreensão de algumas doenças humanas relacionadas a defeitos nos mecanismos de reparo de DNA, visto que, esses sistemas de reparo de DNA são geralmente bem conservados entre procariotos e eucariotos. Além disso, estes resultados permitem uma melhor utilização de C. violaceum como um organismo modelo para estudos em beta proteobactérias e outras bactérias de vida livre.