AVALIAÇÃO DA COLONIZAÇÃO POR METHYLOBACTERIUM SPP., EXPRESSANDO O GENE GFP, EM PLANTAS DE CANA DE AÇÚCAR COM ESCALDADURA DAS FOLHAS.

Fernanda Sousa Bernardes (CENA/USP); Anderson Ferreira (ESALQ/USP); Welington Luiz de Araújo (ESALQ/USP); João Lúcio de Azevedo (ESALQ/USP)

Buscando verificar a colonização e localização de Methylobacterium em cana de açúcar, na ausência e presença de Xanthomonas albilineans, agente causal da doença escaldadura das folhas, isolados de M. extorquens AR 1.6/2 e M. mesophilicum SR 1.6/6 foram modificados geneticamente pela inserção do plasmídeo pCM88. Este plasmídeo expressa o gene da proteína “Green Fluorescent Protein” - GFP, sob controle do promotor LacZ com resistência a tetraciclina e origem de replicação para bactérias metanogênicas. As linhagens transformadas ARgfp (AR 1.6/2) e SRgfp (SR 1.6/6) foram cultivadas em meio CHOI, acrescido de tetraciclina (12,5 µL/mL). A variedade de cana de açúcar SP 801842, pré-inoculada com a bactéria X. albilineans e apresentando os sintomas da doença, recebeu os inóculos de ambas as linhagens transformadas com densidade de 10³ UFCs/mL. O modo de inoculação foi via seringa com aplicação na região da base do colmo. No décimo dia, o colmo foi seccionado e após a assepsia superficial, extraíram-se pequenos fragmentos do tecido vegetal que foram montados sobre lâminas contendo solução de glicerol a 10%. A captura das imagens foi realizada por microscópio óptico de fluorescência. Realizou-se o reisolamento para confirmação e quantificação dos isolados bacterianos introduzidos. Esta avaliação possibilitou identificar, na ausência do patógeno, uma concentração de células de 1,44 x 10¹ UFCs/g e 1,51 x 10² UFCs/g de ARgfp e SRgfp, respectivamente. Na presença do patógeno, o número de unidades formadoras de colônias foram de 1,15 x 10¹ UFCs/g. A observação dos cortes transversais revelou a presença de pequenas partículas fluorescentes nos espaços intercelulares. Este comportamento foi observado em todos os tratamentos expostos ou não à X. albilineans. A colonização dos vasos xilemáticos pelo patógeno foi verificada pela visualização dos agregados celulares fixados à parede do tecido vascular.