COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DE SOLUBILIZAÇÃO DE PROTEÍNAS PARA ANÁLISE PROTEÔMICA DE CRYPTOCOCCUS GATTII

Juliana Ferraz de Correa (UFRGS); Marilene Henning Vainstein (UFRGS)

Cryptococcus gattii é uma levedura basidiomicética que apresenta uma cápsuila polissacarídica, a qual esta relacionada à sua patogenicidade. Essa espécie é um dos agentes etiológicos da criptococose, uma doença sistêmica que pode resultar em óbito. A utilização de técnicas proteômicas para identificação de proteínas envolvidas na interação patógeno-hospedeiro apresenta-se como uma importante ferramenta para a compreensão dos mecanismos envolvidos na infecção. No presente estudo, diferentes métodos de extração/solubilização de proteínas de C. gattii estão sendo avaliados quanto a sua eficiência na resolução das proteínas totais para utilização em eletroforese bidimensional. Após cultivo em caldo Sabouraud a 37°C, as células foram lavadas, liofilizadas e submetidas à extração das proteínas com diferentes métodos de extração/solubilização. Método 1: Extração por maceração com N2 e solubilização em tampão contendo 50mM Tris-HCl pH 7,5; 1mM EDTA; 50uM TPCK; 1mM PMSF; 5mM iodacetamida, método 2: método 1 com acréscimo de 2% de CHAPS no tampão de solubilização, método 3: método 1 com uso de sonicação (3 pulsos de 30 segundos - 20Hz) após o passo de solubilização. As proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford e visualizadas por eletroforese em SDS-PAGE. As condições para a eletroforese bidimensional foram padronizadas sendo ótimas utilizando-se 1,2mg de proteínas totais em tiras de 17cm com faixa de pH de 4-7. Os géis de poliacrilamida foram corados com Comassie G250 e analisados qualitativamente com o software PDQuest Basic 8.0 (Bio-Rad). Foram obtidos 12 mg de proteínas totais no método 1, 16mg no método 2 (30% a mais que no método 1), e 22mg no método 3 (80% a mais que no método 1 e 40% a mais que no método 2). Nas análises preliminares dos géis bidimensionais, apesar de obter-se uma quantidade maior de proteínas no método 3, o método 2 apresentou uma melhor resolução das proteínas em relação aos métodos 1 e 3. Ainda, houve um maior número de spots de proteínas ácidas no método 2, as quais geralmente apresentam difícil solubilização e resolução. Posteriormente, algumas proteínas serão selecionadas para identificação por espectrometria de massas utilizando o programa Mascot e o banco de dados de Cryptococcus neoformans (H99) do Broad Institute a fim de se testar a qualidade e compatibilidade de cada método.