EXPRESSÃO EM ESCHERICHIA COLI, PURIFICAÇÃO, REENOVELAMENTO E ANÁLISE POR INFRAVERMELHO DA PROTEÍNA CAPSIDIAL DO COLE LATENT VIRUS.

Tadaiti Ozato Junior (IBILCE/UNESP); Livia José Regatieri (IBILCE/UNESP); Ricardo Barros Mariutti (IBILCE/UNESP); Luana Gonçales Garcia (IBILCE/UNESP); Marinônio Lopes Cornélio (IBILCE/UNESP); Raghuvir Krishnaswamy Arni (IBILCE/UNESP); José Osmar Gaspar (IBILCE/UNESP)

O Cole latent virus (CoLV) é um fitovírus do gênero Carlavirus,  que apresenta partículas filamentosas com cerca de 650 nm de comprimento e RNA genômico de 8,3 Kb envolto por moléculas de proteína capsidial com cerca de 34 kDa. O RNA genômico dos carlavírus contém seis cadeias abertas de leitura (Open Reading Frame-ORFs). A ORF1 codifica um polipeptídeo com função de metil-transferase, protease, helicase e RNA polimerase dependente de RNA. As ORFs 2, 3 e 4 formam um bloco triplo de genes relacionado ao movimento do vírus célula a célula. A ORF5 codifica a proteína capsidial e a região seguinte codifica uma proteína rica em cisteína cuja função ainda não foi determinada. Este trabalho descreve a expressão, purificação e reenovelamento da proteína capsidial do CoLV e a análise por infravermelho para confirmar a presença de estruturas secundárias na proteína. Os oligonucleotídeos foram desenhados a partir da sequência do CoLV depositada do GenBank e utilizados para amplificação em reações de PCR, utilizando-se como molde o DNA complementar (cDNA) sintetizado a partir do RNA viral. O fragmento amplificado foi clonado em vetor de expressão pET-28a e o vetor recombinante transformado em E. coli (BL21-DE3-RIL). A expressão foi induzida com 1 mM de IPTG por 4 horas e a purificação da proteína recombinante foi feita através de cromatografia de afinidade por metal (Ni-NTA). Foram realizados dois processos de purificação, um em condições nativas e outro em condições desnaturantes com posterior reenovelamento em gradiente de uréia (8 - 0 M). A eluição das proteínas, nos dois processos de purificação, foi feita sob condições nativas com 250 mM de imidazol e a confirmação do reenovelamento da proteína recombinante foi feita pela técnica de espectoscopia de infravermelho (IR). O resultado da purificação foi verificado através de SDS-PAGE mostrando um alto grau de pureza da proteína purificada, com massa molecular de aproximadamente 39 kDa (34 kDa da proteína + 5 kDa da cauda de histidina do vetor). As análises por infravermelho indicaram a presença de estruturas secundárias constituídas de: 41% de folhas-β, 22% de hélices-α, 20% de folhas-β anti-paralelas, 9% de voltas-β e 7% de agregados para a proteína purificada em condições nativas e 38% de folhas-β, 24% de hélices-α, 19% de folhas-β anti-paralelas, 10% de voltas-β e 8% de agregados para a proteína purificada de forma desnaturante com posterior reenovelamento. Esses resultados mostraram, ainda, um alto grau de similaridade conformacional entre as proteínas obtidas nos dois processos de purificação. Estudos posteriores utilizarão a proteína purificada na determinação estrutural por cristalografia de raios-X e produção de antissoro policlonal para análises de imunolocalização em tecidos infectados.