USO DE FINGERPRINT POR RFLP PARA CARACTERIZAÇÃO DE GRUPO DE SOROTIPO EM ISOLADOS DE HAEMOPHILUS PARASUIS

Catia Silene Klein (CNPSA); Raquel Rebelatto (CNPSA); Catiuscia Locatelli (CNPq); Franciana Apaerecida Volpato-bellaver (CNPSA)

O agente causal da doença de Glasser (DG) é a bactéria Haemophilus parasuis, que causa poliserosite e refugagem nos suínos. São conhecidos 15 sorotipos padrão de Hps, que diferem na virulência. A determinação dos sorotipos prevalentes é importante para estudos epidemiológicos e imunológicos, além de servir para direcionar a produção de vacinas. De acordo com as indústrias, a demanda por vacina para controle da DG é elevada e a obtenção de um produto eficaz é difícil devido à grande variedade genotípica e fenotípica entre os isolados. Contudo, a falta de dados epidemiológicos faz com que a composição dos sorotipos de Hps nas vacinas, comercializadas no Brasil, seja baseada em dados de prevalência de outros países, tornando menos eficaz e eficiente o uso do produto. Um estudo de ocorrência de Hps e de prevalência de sorotipos, realizado no Brasil em 1997, reflete apenas a situação da região sudeste e registra um elevado número de amostras não sorotipáveis e a presença de mais de um sorotipo no mesmo rebanho.  As técnicas sorológicas e moleculares tem sido recomendadas para caracterização e identificação do sorotipo presente em isolados, mas até o momento, a técnica molecular que apresentou os melhores resultados na caracterização dos sorotipos de Hps é a RFLP. Neste sentido, a fim de confirmar o resultado de 15 isolados de campo em suínos com sinais clínicos da DG, foi realizada a amplificação por PCR para o gene tbpA, que gera um fragmento de DNA de 1,9Kb. Após, foi realizada a técnica de RFLP destes isolados utilizando a enzima de restrição TaqI, o que forneceu 3 perfis de restrição (B, D e E), sendo que 3 isolados apresentaram o perfil B, 9 o perfil D e 3 o perfil E. Porém, para confirmação do perfil molecular (fingerprint) correspondente ao sorotipo padrão, é necessário realizar restrição/ clivagem com outras duas enzimas, RsaI e AvaI. A combinação dos perfis de RFLP das 3 enzimas permite obter 12 grupos (AAA, BBB, CCC, BAD, DBE, BAF, ECG, BAH, BAI, BAA, EAF, BBJ), sendo 5 perfis com TaqI, 3 com AvaI e 10 com RsaI, possibilitando a diferenciação de 11 sorotipos de Hps. Os sorotipos 5, 12, 14 e 15 apresentam o mesmo perfil, não sendo possível a diferenciação entre eles. Desta forma, o presente estudo mostra a importância da caracterização genotípica por PCR-RFLP em isolados de Hps obtidos de amostras clínicas, para obtenção de dados para posteriores estudos epidemiológicos e para o controle da DG.