DESENVOLVIMENTO DE INICIADORES PARA AMPLIFICAÇÃO POR PCR E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS COM ATIVIDADE ANAMMOX

Aline Viancelli (UFSC); Airton Kunz (CNPSA); Paulo Augusto Esteves (CNPSA); Fernando Viçosa Bauermann (UFSM); Regina Vasconcellos Antônio (UFSC)

Introdução: ANAMMOX (Oxidação Anaeróbia de Amônio) é um processo biológico alternativo na remoção de amônio de águas residuárias. Bactérias envolvidas neste processo têm crescimento lento, o que não permite seu isolamento em cultivos puros. Assim, tecnologias moleculares são aplicadas na identificação. Neste estudo, objetivou-se desenhar um par de iniciadores para amplificar parte do 16S-rDNA de bactérias com atividade ANAMMOX, cloná-los e sequenciá-los, visando identificar bactérias em reator anaeróbio, inoculado com lodo de lagoa de tratamento de dejeto suíno. Material e métodos: No 292º dia de operação de um reator ANAMMOX, coletou-se amostra de material biológico, do qual se extraiu DNA e realizou-se PCR, contendo em 25µL: 10 pmol de cada iniciador complementar a uma região do 16S-rDNA de bactérias ANAMMOX (436F 5'-AGCGGTGAAATGCG-3' e 436R 5'-GGGTTTCGCTCGTTA-3'), 2.5 U de Taq Polimerase, 10% de tampão 10X, 2 mM de MgCl₂, 200 μM de dNTP, 3 ng de DNA e água ultra pura. As condições da PCR foram: 3 min a 95 ºC; 30 ciclos (45 seg a 95 ºC, 1 min a 60 ºC, 1 min a 72 ºC) e 7 min a 72 ºC. O produto da PCR foi clonado (TOPO TA Cloning^®), transformado (Escherichia coli DH5α). DNA plasmidial foi extraído, sequenciado e analisado filogeneticamente. Resultados e Discussão: A taxa de remoção no 292º dia de operação do reator, cuja estequiometria mostrava o estabelecimento de processo ANAMMOX, era de 85% (574 mg L^-1d^-1) do amônio contido na entrada do reator. Dos 12 clones gerados, sete apresentaram identidade com C. Anammoxoglobus propionicus (99 e 100%), esta foi registrada competindo com bactérias pela oxidação de propionato. Um clone mostrou similaridade com C. Jettenia asiática (98%) e Planctomycete KSU-1 (99%), descritos como dominantes em reatores ANAMMOX com remoção de 984 mgN.L^-1d^-1 e 800 mgN.L^-1d^-1. Um clone mostrou semelhança com Pseudomonas sp. (99%) que foram encontradas em reatores convertendo NO^-₃ em N₂. Três clones apresentaram semelhança com clones não cultivados. Conclusão: Através dos novos iniciadores detectaram-se organismos com atividade ANAMMOX em reator inoculado com lodo de lagoa de tratamento de dejeto suíno.