CLONAGEM MOLECULAR, ANÁLISE DA EXPRESSÃO E LOCALIZAÇÃO DE UMA NOVA PROTEÍNA GPI DE PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS

Clarissa Xavier Resende Valim (FMRP-USP); Paulo Sergio Rodrigues Coelho (FMRP-USP)

O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). A parede celular tem uma função chave na relação entre as células fúngicas e as células do hospedeiro. A parede celular é constituída, principalmente, por proteínas ligadas a âncoras de GPI. Muitas proteínas ancoradas a GPI estão envolvidas na morfogênese e na organização da parede celular e participam da sua biossíntese e do seu remodelamento. A Pbpga1 é uma proteína GPI predita de P. brasiliensis que apresenta identidade de 60% a 32% somente com proteínas fungo-específicas de função desconhecida. Através de ferramentas de bioinformática, confirmamos a presença de um peptídeo sinal de importação para o retículo endoplasmático, a ausência de domínios transmembrânicos, a presença de cerca de 26% de serinas e treoninas, possivelmente, o-glicosiladas e identificamos um predito sítio-ω na posição N203. A Pbpga1 apresenta ainda um domínio rico em glicina e serina de função desconhecida, que é conservado em proteínas GPI denominado DUF24.01. A análise da expressão do gene PbPGA1 por Real Time PCR revelou que esse é expresso diferencialmente entre as formas de hifa e levedura, apresentando-se 3 vezes mais expresso na fase leveduriforme. A Pbpga1 recombinante foi produzida em bactérias E. coli  e a proteína purificada foi utilizada na produção de anticorpos policlonais anti-GST-Pbpga1 em camundongos C57/BL6. O anticorpo reconhece a proteína recombinante truncada GST-Pbpga1 com aproximadamente 35 kDa, cuja identidade foi verificada por espectometria de massa bem como, uma proteína endógena de 45 KDa em extratos de hifas e leveduras de P. brasiliensis. Através de imunofluorescência utilizando o anticorpo anti-GST-Pbpga1, a proteína foi localizada em células leveduriformes. A proteína Pbpga1 foi detectada na superfície celular sendo observada na base dos brotos de células-mãe, mas não em células-filhas. Algumas vezes a Pbpga1 é observada em forma de um anel, envolvendo a base do broto. Em células em fase de transição de levedura para hifa observamos a Pbpga1 polarizada localizada na região apical das hifas em formação, mas também pode se encontrar o padrão de marcação observado para as formas de levedura. A identificação de uma nova proteína GPI fungo-específica na parede celular de P. brasiliensis é de suma importância para a contribuição da evolução no entendimento desse microorganismo.