OTIMIZAÇÃO DE TESTE DE PCR PARA CARACTERIZAÇAO DE HAEMOPHILUS PARASUIS EM ISOLADOS BACTERIANOS NAD-DEPENDENTES

Raquel Rebelatto (CNPSA); Catia Silene Klein (CNPSA); Franciana Aparecida Volpato Bellaver (CNPSA); Catiuscia Locatelli (CNPq)

Hemophilus parasuis (Hps) é o agente causal da doença de Glässer, caracterizada por polisserosite fibrinosa, meningite e poliartrite, que causa grandes perdas econômicas na criação de suínos em todo o mundo, inclusive no Brasil. O Hps é uma bactéria fastidiosa, o isolamento e cultivo a partir de amostras clínicas de suínos nem sempre é possível, devido ao uso indiscriminado de antibióticos e aos métodos laboratoriais pouco sensíveis ou indisponíveis nos laboratórios do Brasil. Assim, resultados negativos no cultivo não indicam ausência do agente no rebanho. Atualmente, somente o isolamento bacteriológico e a caracterização taxonômica de Hps é realizada na maioria dos laboratórios de diagnóstico. Por isso, a PCR é útil como um teste rápido para caracterização do isolado. Neste sentido, foi realizada otimização da técnica para o gene tbpA, que amplifica um produto de 1,9Kb  e está presente nos 15 sorotipos de Hps. As condições do teste foram de acordo com a descrita por De La Puente Redondo et al. (2003).  Os produtos de PCR amplificados para o gene tbpA dos 15 sorotipos padrão foram seqüenciados e analisados com o programa BLAST. Todas as sequências analisadas apresentaram homologia acima de 95% com as sequências depositadas no GeneBank,confirmando a amplificação específica do produto de Hps.  A fim de determinar a especificidade analítica do teste, foram feitos 10 ensaios, em dias alternados, com outros patógenos do trato respiratório dos suínos como A. indolicus, A. porcinus, A. minor, A. suis, A. pleuropneumoniae (App), Bordetella bronchiseptica (Bb) e Pasteurella multocida. Destes, apenas Bb e App apresentaram amplificação  de produto com tamanho diferente do produto de Hps, não interferindo na interpretação do resultado. Além disso, foram realizados 5 ensaios para determinação do número mínimo de UFC necessário para detecção pela PCR.  O ensaio foi realizado por meio de diluições seriadas na base 10 e, após, de cada tubo de diluição foi retirado uma alíquota de 1mL para extração de DNA e PCR e outra alíquota de 0,1mL para contagem de UFC, em triplicata e em meio de cultura TA como soro e NAD. Foi determinado como limite mínimo de detecção 2,38 x 10⁹ UFC/ mL, esta quantidade é elevada, porém não foram encontradas publicações para este agente. O teste mostrou-se útil para o diagnóstico e na caracterização de Hps a partir de cultura bacteriana suspeita.