ESTRATÉGIA DE CLONAGEM DO FRAGMENTO VARIÁVEL DE CADEIA ÚNICA (SCFV) DO ANTICORPO ANTI-INTIMINA

Márcio Anunciação Menezes (IBu); Karina Araujo Aires (IBu); Renato de Mello Ruiz (IBu); Christiane Yumi Ozaki (IBu); Waldir Pereira Elias Junior (IBu); Roxane Maria Fontes Piazza (IBu)

Introdução: A adesão de E. coli enteropatogênica (EPEC) e enterohemorrágica (EHEC) ao enterócito é mediada pela intimina, uma proteína de membrana externa de 94 kDa que contém uma região conservada N-terminal imunogênica, portanto um excelente alvo para diagnóstico. Embora tenha apresentado boa especificidade no immunoblotting, o anticorpo monoclonal IgG2b anti-intimina falhou em detectar alguns isolados de EPEC. Além disso, a obtenção de anticorpos a partir de hibridomas tem alto custo. Um modelo alternativo de produção de anticorpos é a geração do fragmento variável de cadeia única (scFv) em sistemas de expressão heterólogos. Objetivo: Clonagem de scFv anti-intimina em uma estratégia de amplificação utilizando iniciadores específicos para unir as cadeias da fração variável. Metodologia: O mRNA foi extraído de hibridomas IgG2b anti-intimina e reversamente transcrito para cDNA. As cadeias leve (CL) e pesada (CP) da fração variável foram amplificadas por PCR utilizando um kit comercial. Foi utilizada uma estratégia de clonagem de scFv em 4 etapas. 1^a: quatro iniciadores foram desenhados para amplificar CP e CL, sendo que os iniciadores reverso da CP e forward da CL apresentavam regiões complementares ao linker (fragmento de DNA que liga a CP à CL), e os iniciadores forward da CP e reverso da CL continham os sítios BamHI e HindIII, respectivamente. 2^a: a CL foi re-amplificada utilizando o linker como iniciador forward (gerando o produto Linker-CL). 3^a: a CP e o Linker-CL foram unidos por PCR por complementariedade das porções 3' da CP e 5' do Linker-CL, e utilizando os iniciadores CP forward e CL reverso. O scFv obtido foi clonado em vetor de expressão pAE digerido com BamHI e HindIII. Resultados: Utilizando os iniciadores sintetizados, as CP e CL foram amplificadas, resultando em uma banda de 330 pb cada. A ligação por PCR de CP e Linker-CL gerou um fragmento de 720 pb, correspondente ao esperado para o scFv. Discussão: O processo de clonagem de scFv exigiu estratégias no desenho dos iniciadores e na abordagem de amplificação, uma vez que a primeira amplificação das cadeias foi realizada utilizando iniciadores aleatórios de um kit, gerando um stop codon prematuro em scFv. Os iniciadores específicos permitiram a correta clonagem de scFv. Esta técnica permitirá a expressão em larga escala de anticorpos com baixo custo para o diagnóstico de EPEC e EHEC.