TRANSFORMAÇÃO DE BURKHOLDERIA TROPICA UTILIZANDO PLASMÍDEO SINTÉTICO COM MARCAÇÃO POR GENE REPÓRTER

Thaís de Freitas Oliveira (Embrapa/UFRRJ); Verônica M. Reis (Embapa CNPAB); José Ivo Baldani (Embapa CNPAB); Stefan Schwab (Embapa CNPAB)

Burkholderia tropica é uma bactéria endofítica fixadora de nitrogênio normalmente encontrada em associação com arroz, milho, cana-de-açúcar, sorgo e gramíneas forrageiras. Quando inoculada em cana-de-açúcar em conjunto com outras bactérias endofíticas fixadoras de nitrogênio é capaz de promover o crescimento vegetal, principalmente em solos pobres em N, aumentando a produtividade da cultura agrícola. Esforços têm sido realizados para se compreender os fundamentos dessa interação bactéria-planta-ambiente, e explorar o efeito benéfico desses microrganismos. Entretanto, ainda existe um vasto campo de conhecimento a ser prospectado, como por exemplo, em relação à sua fisiologia, bioquímica e genética. Com o objetivo de avaliar a regulação da expressão gênica em B. tropica foi otimizado um protocolo de transformação da estirpe Ppe8 com um vetor (plasmídeo) de amplo espectro hospedeiro contendo o gene repórter lacZ. Para tanto, foram comparados novos meios de cultura e condições de cultivo em relação aos meios e condições previamente estabelecidos. Também foi determinada a concentração mínima inibitória (CMI) dos antibióticos tetraciclina, ampicilina, canamicina, gentamicina, estreptomicina e cloranfenicol para o crescimento da estirpe Ppe8 visando definir o antibiótico e a concentração adequada para a seleção de células bacterianas transformadas. Além disso, foram testados sete plasmídeos (pHRgfpgus, pTnmod-0GmKmlacZ, pMP4641, pMP5458, pMP4662, pHRgfpTc e p2) e os parâmetros relacionados ao pulso elétrico aplicado durante o processo de eletroporação. Os resultados mostraram que o antibiótico tetraciclina foi aquele que apresentou menor CMI seguido dos antibióticos gentamicina, canamicina, estreptomicina, cloranfenicol e ampicilina. Desta forma, o antibiótico tetraciclina foi escolhido para os  ensaios de transformação da estirpe Ppe8. Dentre os sete plasmídeos testados foi observado células transformadas somente com o plasmídeo p2 que carrega a marca de seleção para tetraciclina e o gene repórter lacZ. Apesar de a estirpe Ppe8 ter apresentado atividade de Beta-galactosidase (LacZ) endógena (o que dificultaria a utilização do respectivo gene repórter), o plasmídeo citado ainda apresenta o potencial de uso caso o seu gene repórter for substituído por outros genes do tipo gfp ou gus. Os procedimentos e plasmídeo estabelecidos neste trabalho abrem á possibilidade de se estudar a genética dessa bactéria fixadora de nitrogênio através de fusões gênicas com gene repórter e/ou utilizar a bactéria como vetor de expressão gênica em planta, entre outras aplicações.