| Área: Genética e Biologia Molecular ( Divisão N )
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DA NITROGENASE, GLUTAMINA E GLUTAMATO SINTETASE POR QRT-PCR EM UM MUTANTE HISTIDINA QUINASE (GDI3079) DE GLUCONACETOBACTER DIAZOTROPHICUS
Helma Ventura Guedes (CNPAB); Luc Felicianus Marie Rouws (CNPAB); Sylvia Maria Campbel Alquéres (UFRJ); Stefan Schwab (CNPAB); Jean Luiz Simões-araújo (CNPAB); Orlando Bonifácio Martins (UFRJ); José Ivo Baldani (CNPAB)
Resumo
Bactérias alteram o seu metabolismo e transcrição de genes frequentemente em função de flutuações ambientais tais como: mudanças na osmolaridade e disponibilidade de nutrientes. Em geral mudanças no meio ou intracelulares são detectadas por mecanismos de transdução de sinais que consistem de uma proteína sensora histidina quinase e um regulador de resposta que mediam a expressão diferencial de genes. Um mutante histidina quinase (GDI3079) de Gluconacetobacter diazotrophicus estirpe PAL5 foi obtido pela seleção de mutantes com baixa atividade da nitrogenase, empregando o método de enriquecimento com ampicilina, a partir de uma biblioteca de mutantes Tn5. A análise in silico da sequência que contém inserção única do Tn5 mostrou que o gene putativo codifica um polipeptídeo de 467 aminoácidos e contém os domíneos HiskA, HATPase_C, Hamp e dois domínios transmembrana. A análise BLAST-P revelou um alto grau de similaridade com a proteína osmo-sensora EnvZ de Escherichia coli que está associada ao regulador transcripcional ompR, formando um sistema sinalizador de dois componentes. A análise do transcriptoma de E. coli apontou o potencial do sistema EnvZ/OmpR na regulação de mais de 100 genes, sugerindo que OmpR funciona como regulador global. Com o objetivo de avaliar se a expressão dos genes que codificam para a nitrogenase, glutamina e glutamato sintase é afetada no mutante histidina quinase de G. diazotrophicus foi desenvolvido o presente trabalho. As estirpes selvagem (PAL5T) e mutante foram inoculadas em meio LGI-P líquido contendo 1 mM de sulfato de amônio e mantidas à 30ºC sob agitação de 100 rpm durante 6 dias. Nesse período foi medida a atividade da nitrogenase pela técnica de Redução de Acetileno, e no pico de maior atividade da nitrogenase, foram coletadas células para extração do RNA total e posterior análise por qRT-PCR (real time quantitative RT-PCR). Os resultados demonstram que a expressão relativa da nitrogenase no meio LGI-P é muito menor no mutante do que em PAL5T, já a expressão relativa da glutamina e glutamato sintase foi maior (2 vezes e 2,5 vezes respectivamente) no mutante do que na selvagem. Os resultados obtidos sugerem que a histidina quinase (GDI3079) pode estar envolvida com a regulação do processo de Fixação Biológica do Nitrogênio em Gluconacetobacter diazotrophicus.
Palavras-chave: FBN, Histidina quinase, Nitrogenase |